脂联素对动物脑损伤的影响及机制

李嘉鑫,魏诗音,姚泽龙,邢晓钰,孔燕明,刘 聪,曹中赞,栾新红

(沈阳农业大学动物科学与医学学院,辽宁沈阳 110161)

从形态学、分子学、功能及行为等角度来看,大脑是动物所拥有的最有趣、最具有吸引力的器官之一[1]。病原微生物等因素可以诱发动物的脑损伤,进而对动物的健康和生产活动造成诸多负面影响[2]。因此,提高对动物脑部疾病的关注,以及寻求有效的治疗方法是急需的。脂联素(adiponectin,APN)是一种由脂肪组织分泌的细胞因子,可调节代谢过程、提高抗氧化水平。脂联素及其受体介导的信号通路在多种系统疾病中已被广泛研究[3]。此外,脂联素受体在脑组织的许多区域高表达,在小鼠的下丘脑、脑干、皮质神经元和内皮细胞以及全脑和垂体提取物中均检测到它们的表达。关于脂联素的脑保护作用受到了越来越多的重视,尤其是脂联素的生物学作用在动物脑损伤发病机制中的应用。可以期待,脂联素可能在动物脑损伤的治疗中发挥重要作用。

1 脂联素及其受体

1.1 脂联素的结构

脂联素是一种分子质量约为30 ku的多肽蛋白,属于可溶性胶原超家族。编码脂联素的基因主要在脂肪细胞中表达,受到CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins,C/EBPs)、激活蛋白-1(activator protein1,AP-1)等转录因子的调控。不同动物体内组成脂联素的氨基酸数量存在一定差异,小鼠脂联素含有247个氨基酸,鸡和鹅脂联素则含有245个氨基酸。脂联素由4个结构域组成,包括靶向细胞外分泌激素的N端信号肽、短可变区、胶原结构域和C端球状结构域[4]。脂联素N端区域含有1个半胱氨酸残基,通过这个残基形成分子间的二硫键对脂联素的多聚和分泌至关重要。其次,N端区域与任何其他蛋白质没有结构同源性,并且在不同物种之间存在结构差异[5]。相反,球状结构域与包括补体因子C1q、α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在内的蛋白质在结构上相似,具有高度同源性。

脂联素主要在细胞内产生,其单体蛋白通过糖基化和羟基化进行翻译后被修饰成3种主要亚型分泌进入血液中,包括三聚体(分子质量约为90 ku)、六聚体(分子质量约为180 ku)及多聚体(分子质量约为360～540 ku)[6]。在血液循环中,脂联素主要以这些全长形式存在,此外,循环中也发现了一种由全长脂联素蛋白水解产生的球状脂联素形式[7]。脂联素的每种分子形式都被证明具有不同的生物学功能。有研究指出,全长脂联素能够促进葡萄糖摄取和脂肪酸氧化及增加胰岛素敏感性,球状脂联素则能够激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)途径等[8]。

1.2 脂联素受体及其信号转导

既往研究表明,脂联素的多效性作用是其通过与3种受体结合介导的,即脂联素受体1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)、脂联素受体2(adiponectin receptor 1,AdipoR2)及T-钙黏蛋白。AdipoR1和AdipoR2于2003年首次被克隆出来,分别位于染色体1p36.13-q41、1 E4及染色体12p13.31、6 F1上,二者都是完整的膜蛋白,包含7个跨膜结构域,由细胞内NH2末端结构域和细胞外COOH末端结构域组成[9]。AdipoR1和AdipoR2在结构上具有显著的同源性,并显示出67%的氨基酸一致性,但这2种受体对不同脂联素异构体的亲和力有所差异。小干扰RNA转染诱导抑制AdipoR1和AdipoR2显示,AdipoR1对球状脂联素具有高亲和力,而AdipoR2对全长脂联素和球状脂联素的亲和力均处于中等水平[10]。脂联素受体的表达是独特而广泛的,并且具有组织特异性,动物体内的肌肉、大脑及心脏等多种组织中都有脂联素受体的表达与分布。据其组织表达谱显示,AdipoR1主要在骨骼肌和肝脏中广泛表达,而AdipoR2在肝脏中表达最丰富。脂联素功能的另一个关键调节因子是2004年发现的T-钙黏蛋白受体,其是一种非典型的糖基磷脂酰肌醇锚定的钙黏蛋白。尽管T-钙黏蛋白受体没有膜或胞内结构域,但它在平滑肌、内皮细胞及神经元中结合脂联素和促进脂联素信号传导中发挥重要作用[8]。

AdipoR1及AdipoR2都与一种核内体相关的磷酸酪氨酸衔接蛋白1(leucine zipper motif 1,APPL1)相互作用。APPL1已被证明是脂联素受体链接下游信号通路的关键中介,包含磷酸化酪氨酸结构域(phosphoty rosine binding domain,PTB)、pleckstrin同源结构域(pleckstrin homology do main,PH)和亮氨酸拉链基序,其通过PTB结构域直接与脂联素受体细胞内NH2末端区域结合[11]。脂联素通过其受体与APPL1结合诱导了多个靶组织中p38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases,P38MAPK)、AMPK、过氧化物酶体增殖活化受体α(peroxisome proliferators-activated receptor-α, PPARα)及胰岛素受体底物蛋白1(insulin receptor substrate-1,IRS1)等下游信号分子的激活。APPL1与脂联素受体的结合增加了AMPK、p38MAPK的磷酸化,并增强了PPARα配体的活性,诱导了脂肪酸氧化和葡萄糖消耗增加。在过表达APPL1的小鼠肝细胞中,p38 MAPK被激活,这表明APPL1在脂联素信号通路中发挥了作用。另一方面,APPL1可调节脂联素诱导的心肌细胞脂肪酸氧化,脂联素增加了APPL1与AMPK的体外结合,也增加了心肌细胞的耗氧量。此外,脂联素还可以激活IRS1磷酸化和下游的磷脂酰肌3激酶/蛋白激酶B轴(phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K)/protein kinase B(Akt),PI3K/Akt),以促进应激后肌肉和肝细胞的细胞存活。

2 脂联素对动物脑损伤的影响及机制

关于脂联素在外周系统疾病中的有益作用已有大量的文献报道,与之形成鲜明对比的是脂联素在中枢神经系统疾病中的作用仍然知之甚少。虽然脂联素在大脑中的作用尚未得到很好的阐述,但不可否认的是,人们对脂联素及其脑保护作用的理解一直在大大增加。越来越多的证据表明,脂联素可以在动物脑损伤的发病机制中发挥重要的治疗保护作用[12-13]。

2.1 脂联素与脑组织炎症反应

过度的炎症反应是导致脑损伤发展的主要病理原因之一,其特征不仅是小胶质细胞的持续激活、星形胶质细胞增生和TNF-α、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等炎症介质的持续释放,还包括氧化和硝化应激的增加[19]。一系列的病理变化损坏了血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的完整性,导致了外周单核细胞渗入脑组织,维持甚至放大炎症,加重脑损伤[14]。因此,抑制炎症反应对于缓解脑损伤具有重要意义。大量的体内和体外研究表明,脂联素具有抗炎活性,广泛参与炎症过程。在外周,脂联素的主要细胞靶点是肝细胞、心肌细胞、巨噬细胞/单核细胞等,但在中央层面上,可用的数据要少得多。尽管这一点一直存在争议,但现在研究者们已证实脂联素受体在脑组织(如:皮层、下丘脑、脑下垂体、脑干和海马)中广泛存在并且脂联素可以穿过BBB到达脑实质,在那里发挥抗炎作用[15-16]。

小胶质细胞作为脑组织内的巨噬细胞,它的激活及其介导的神经炎症级联反应在多种刺激诱发的脑损伤病程中具有促进作用[17]。在感知来自外源性刺激的信号后,静息的小胶质细胞被激活,与病原体或外源性配体相互作用,诱导TNF-α、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)等炎症细胞因子和各种信号传递,进一步加重局部免疫细胞浸润及神经元损伤[18]。脂联素能通过与AdipoR1及AdipoR2相结合抑制TNF-α等促炎细胞因子的表达,缓解小胶质细胞介导炎症反应。Nicolas S等[19]发现,与野生小鼠相比,脂联素缺失小鼠的小胶质细胞对促炎刺激的反应性更强,表现出了对神经炎症更高的敏感性。该团队进一步研究结果表明,脑室内注射球状脂联素(gAPN)可以通过AdipoR1/ AMPK/核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路抑制小胶质细胞中脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导的IL-1β、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和TNF-α合成、活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基的产生,进而对小胶质细胞发挥直接的体内抗炎作用[25]。在淀粉样蛋白β低聚物处理的小胶质细胞中,脂联素可以抑制小胶质细胞中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的释放、NF-κB的核易位及 AMPK磷酸化,这种对小胶质细胞的抗炎作用是通过AdipoR1-AMPK-NF-κB信号通路调控的。其次,球状脂联素(Acrp30)亦可通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)信号途径减少暴露于淀粉样蛋白β低聚物中的小胶质细胞的促炎反应并促进抗炎反应。此外,脂联素还可以通过调节小胶质细胞的极化来发挥抗炎作用。小胶质细胞激活后通常发展为2种表型,包括促进炎症反应的经典激活表型(M1极化)及分泌抗炎细胞因子和生长因子的替代激活表型(M2极化)。在特定的微环境中,已经完全极化的M1或M2亚群可以逆转其表型和功能,因此,促进小胶质细胞从M1向M2表型转化的策略给脂联素在脑损伤中的防治提供了新的思路。在脑缺血模型中,脂联素通过增强AdipoR1/APPL1/肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/AMPK/PPARγ信号通路促进了小胶质细胞表型由M1向M2的转化,进而减轻了炎症反应[20]。星形胶质细胞是脂联素在脑组织中启动抗炎效应的另一个靶点。Wu X等[21]通过mRNA测序和转录组分析表明,脂联素肽可显著减轻脑出血诱导的星形胶质细胞炎症反应和线粒体呼吸功能障碍,进一步研究发现,脂联素肽增加了AMPK激活,从而抑制了线粒体裂变关键蛋白(dynamin-related protein 1,DRP1)向线粒体膜的易位,减少了线粒体碎片化和线粒体超氧化物的产生,从而减轻了星形胶质细胞来源的炎症反应。总的来说,脂联素似乎通过多种机制在动物脑组织内发挥抗炎作用,但其可能的机制尚未完全阐明。

2.2 脂联素与脑组织氧化应激

众所周知,大脑具有高于其他器官的耗氧量和代谢活动,抗氧化水平较弱且脂质含量高度丰富,极易受到氧化应激的影响。氧化应激是ROS自由基[如羟基自由基(OH·)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)]产生和抗氧化剂降解之间的一种不平衡状态。这种氧化还原失衡是由于ROS生成增加和抗氧化防御系统减少而发生的[22]。虽然ROS通过不同的代谢过程正常产生,但过量的ROS会引起炎症并对生物分子产生有害影响,导致脂质过氧化、DNA 损伤和突变,进而引起细胞死亡及机体组织的氧化损伤[23-24]。在目前的情况下,通过加入一些抗氧化物质提高机体组织内的抗氧化物酶水平是清除ROS及对抗氧化损伤的主要策略。

越来越多的证据表明,脂联素是一种有效抗氧化物质。它对产生ROS的信号通路有负调控作用,可以促进机体组织内过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗氧化物酶表达,抵消细胞内氧化产物的过度积累,从而阻止氧化应激的产生[25-26]。在脂联素处理的衰老H9c2心肌细胞中,ROS、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量及高迁移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1,HMGB1)的蛋白表达下降,血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的蛋白表达增加,表明脂联素可通过抑制HO-1/HMGB1信号通路减轻衰老H9c2细胞的氧化应激[27]。高脂饮食会导致豁眼鹅肝组织中MDA的含量升高、SOD、CAT 的含量降低,而适当剂量的外源脂联素受体激动剂处理可以逆转这些变化,提高肝脏的抗氧化能力,减轻氧化应激引起的肝损伤[28]。磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH)氧化酶是ROS的酶促来源之一,球状脂联素可以通过抑制NADPH氧化酶介导的氧化损伤信号级联来减轻脑再灌注损伤,球状脂联素处理后可以增加脑组织内抗氧化能力、上调下游信号分子SOD、CAT的含量及降低MDA的生成。另一项研究表明,脂联素多肽的保护作用在很大程度上是通过抑制NADPH氧化酶介导的氧化应激实现的,给予脂联素多肽后羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE),8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)氧化应激相关蛋白表达水平及ROS含量显著下降,线粒体超微结构损伤得到缓解。此外,氧化损伤是脑外伤后继发性脑损伤的重要标志,脂联素/脂联素受体信号通路通过激活AdipoR1发挥作用,进而增加去乙酰化酶3(silent information regulator 3,SIRT3)的蛋白表达,促进线粒体抗氧化能力的恢复,发挥其在抗氧化应激、抗凋亡和预防创伤性脑损伤中的作用[29]。

2.3 脂联素与脑组织细胞凋亡

神经元是动物脑组织的基础,不可再生,一旦凋亡难以恢复,因此出现在外伤性脑损伤、脑缺血等多种脑组织病理情况下的细胞凋亡是极其有害的[30]。细胞凋亡过程受到B淋巴细胞瘤/白血病-2(B-cell cymphoma/euke-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白质(Bcl-2 associated X,Bax)和半胱天冬酶 (caspase)等基因精确调控。Bax和Bcl-2相互作用致使线粒体通透性增加和凋亡相关酶释放增多,从而促进了凋亡反应[31]。此外,脑组织细胞凋亡也受到caspase的外源性途径的调控。这两种途径最终激活凋亡的最终执行者半胱天冬酶-3 (caspase-3),活化的caspase-3破坏了广泛的稳态、修复性和细胞骨架蛋白,并导致神经元细胞死亡[32]。神经元凋亡的分子机制给脑损伤防治提供了新的思路,如何找到抑制非生理性细胞凋亡的关键因子也成为了研究热点。

近年来,脂联素对于细胞凋亡的影响受到了很多的关注,多项研究表明,脂联素与其受体相结合可通过多种信号通路调控细胞凋亡,发挥其保护作用。在LPS处理的心肌细胞中,脂联素可通过激活PI3K/AKT信号通路下调caspase-3与Bax的活性来保护脓毒症诱导的心肌细胞凋亡[33]。其次,脂联素还可作用于AMPK/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路,减轻脓毒血症诱导的肝细胞凋亡,缓解肝损伤[34]。此外,脂联素介导的APPL1/AMPK信号通路也能减弱缺氧缺血诱导的大鼠的神经元凋亡。在该研究中,脂联素处理组大鼠脑萎缩区域减小,神经元凋亡减少,同时AdipoR1、APPL1和p-AMPK的蛋白表达增加。与脂联素的抗凋亡活性一致,在胶原酶诱导的脑出血模型中,重组脂联素肽可显著缓解脑水肿及神经细胞凋亡,从机制层面来说,重组脂联素肽通过降低激活转录因子4及环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白的表达,缓解了神经元凋亡[35]。

3 总结与展望

近年来,对脂联素及其受体的表达和功能的研究已经从外周组织器官延伸到了中枢神经系统。尽管脑组织中脂联素及其受体信号传导级联以及作用脑损伤的特异性机制仍需要更加深入的调查,但越来越多的证据表明,脂联素可能是治疗保护脑组织的重要因子。基于脂联素以及脂联素受体的分子结构及其在脂类代谢、抗炎、抗氧化应激和抗凋亡方面的生物学功能,将来可以开发脂联素及其类似物相关的临床药物,用于防治动物脑损伤方面的疾病。