基于软光刻的高分子生物材料表面图案化及改性研究进展

管 馨 翁鑫泽 赖颖真 郑晓丹

厦门医学院口腔医学系 口腔生物材料福建省高校工程研究中心，福建厦门 361023

生物材料表面的微形貌可以通过简单地模仿细胞内的地形线索，从而影响细胞的黏附、增殖、分化，最终影响缺损组织的修复[1]。如沟槽、条纹等各向异性图案可使细胞骨架改变，在微纳米尺度上与形貌方向对齐，形成“接触诱导”效应。而坑、桩等随机或均匀分布的各向同性图案能够在微米尺度上影响细胞群体化行为，诸如细胞黏附程度、铺展面积、信号传导等[2]。生物材料表面图案化改性应用广泛，通过调节细胞-材料相互作用，以图案化表面“接触诱导”促进细胞纯化[3]；以表面微形貌促使细胞取向排列，如通过条纹状表面实现肌细胞定向生长[4]；以微纳米结构的比表面积不同影响培养液中蛋白沉积，影响细胞初始黏附[5]；通过表面物理线索，促使细胞骨架产生应力，引起细胞核形态改变及随后的基因表达和功能的改变[6]。

随着微加工技术的发展，可以通过光刻技术、软刻蚀技术等在不同基材表面实现图案化。Whiteside GM 提出一套新的软光刻图形技术，该方法使用1 个弹性印章作为中间模板，将图案转移到目标材料，其中最常用于制备弹性印章的材料是聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）[7]。现基于软光刻技术中的PDMS 弹性印章，对如何实现生物材料表面图案化作一总结。

1 热塑性生物材料表面图案化

热塑性材料具有加热软化、冷却硬化的特点，根据基本化学结构可分为聚酯、聚烯烃、聚醚、聚酰胺等种类。其中在组织工程较为关注的有聚己内酯（polycaprolactone，PCL）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）等聚酯类，聚烯烃类（聚乙烯醇）及聚芳香醚类（聚醚醚酮）等。

对于热塑性生物材料的表面图案化可采用熔融浇铸法。例如PCL，以二氯甲烷为溶剂将PCL 颗粒制备成PCL 膜，置于PDMS 表面，在真空条件下，70 ℃加热4 h，取出，待其冷却凝固后剥离，即得到图案化PCL 膜。研究显示，类骨单位同心圆微沟槽结构能够促进干细胞成骨且显著抑制RAW264.7 细胞的破骨分化[8]。Barata 等[9]在150 ℃下，将PDMS 模具置于PLA 膜上，热压印15 min，将双光子聚合结构复制到PLA 中，冷却脱模即得到图案化PLA 膜，同时发现微结构的尺寸对细胞骨架和细胞核有明显影响。

除单一材料表面图案化外，还可尝试利用多种材料进行图案化。潘崇双[10]用三氯甲烷溶解PLA、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）制备PLA/PEG 共混膜，发现PEG 的加入使复合材料的亲水性得到改善，韧性更高。在此基础上，是否可以将PLA/PEG 置于PDMS 模板上熔融浇铸，得到物理、机械性能改良的图案化复合膜，有待进一步尝试。

2 热塑性生物材料表面改性的方法

热塑性材料具有良好的可降解性，机械强度高，易于加工；但其缺乏细胞识别位点，亲水性不良，不利于细胞的黏附生长，需要再次表面改性[11]。现对表面改性的方法作一概括总结，为在不影响材料表面形貌的基础上提供改性思路。

2.1 表面化学修饰

有学者水解处理PCL 膜增加其亲水性，在此基础上还可二次修饰[12]。朱旸[13]在PCL 膜胺解处理后接枝阿仑膦酸钠，所接枝的阿仑膦酸钠对干细胞有明显的促成骨分化作用，上述实验中薄膜表面形貌未产生显著变化。另一项实验采用γ-射线辐照，所接枝的聚丙烯酸链将银纳米离子负载到PLA 膜表面，低银含量的PLA 薄膜表现出优异的亲水性和抗菌活性[14]。

2.2 表面纳米级形貌修饰

采用物理或化学手段在微米级拓扑结构的表面修饰纳米级形貌，以达到微纳米双重结构对细胞生物学行为的调控。Zamani 等[15]将PCL 支架浸泡于氢氧化钠中，发现支架形貌由光滑变为蜂窝状，其中氢氧化钠处理24 h 可同时促进细胞增殖和基质沉积。Park 等[16]使用氧等离子体处理PCL 支架表面，发现支架表面被精细刻蚀、粗糙度增加，促进人牙髓干细胞成骨分化。未来研究可利用碱、等离子等处理，尝试在微米级结构上修饰规则或不规则纳米级形貌，从而实现对细胞行为的双重调控。

2.3 表面生物涂层修饰

使用涂覆、浸泡等方法在材料表面修饰胶原、壳聚糖（chitosan，CS）等高分子材料或添加细胞因子、分泌物等生物活性物质，进一步提高材料性能。Zhao 等[17]在PCL 膜氧等离子活化处理后置于胎牛血清中浸泡以提供蛋白来源，表面共价交联水凝胶赋予高度细胞相容性。Park 等[18]在支架材料浸泡聚多巴胺后以生物矿化引入羟基磷灰石颗粒层，使骨组织有效再生。赵金龙等[19]通过浸泡将血小板衍生生长因子-BB 引入支架材料中，发现随着血小板衍生生长因子-BB 溶液质量浓度增加，干细胞成血管相关基因表达增高。

3 非热塑性或熔点较高的生物材料表面图案化

对于非热塑性或熔点较高的生物材料的表面图案化可采用溶液浇注法，常用于生物组织工程的有CS、琼脂糖（agarose，AG）、水凝胶、胶原、丝素蛋白（silk fibroin，SF）等。

CS 加热到一定温度后会直接分解，用乙酸为溶剂配制成CS 溶液，倾倒于PDMS 模板上，挥发溶剂干燥，即得到图案化CS 膜，发现沟槽的宽深比显著影响干细胞的“架桥”行为[20]。琼脂糖含有多个羟基，亲水性强，只溶解于热水和有机溶剂，当温度在35～45 ℃时会形成良好的半凝固体状凝胶[21]。基于此特性，90 ℃水浴加热配制AG 溶液，迅速浇注在PDMS 基底上，冷却揭下得到图案化AG 凝胶，此外还可将AG 作为影印图案的印章以制备矿化钙磷纳米颗粒微图案化的人工仿生骨膜，促进干细胞成骨分化[22]。水凝胶可以模拟水含量、机械性能和纤维网络等人体自然组织的属性。Jayasinghe 等[23]使用乙二醇和水配制水凝胶混合溶液，随后倾倒在PDMS 模具上，使用Dymax 光固化系统365nm 紫外光固化90s，在磷酸盐缓冲液中脱模，微柱阵列图案可以增加细胞的附着。胶原为哺乳动物组织中含量最多的一类蛋白，具有良好的生物相容性和可降解性，交联改性增强力学强度，被广泛用于生物组织工程。熊思佳[24]在胶原溶液交联固化后，去除气泡浇注于PDMS 模板表面，自然风干得到微沟槽胶原膜，微沟槽结构诱导角膜上皮细胞定向排列及迁移，加快伤口愈合。SF 为蚕丝的主要成分，具有独特的力学性能，采用水解的方法制备出不同形式的产物，如SF 膜、SF 凝胶、SF 支架等[25]。有学者在PDMS 模板表面，将SF 溶液以滴加或涂抹形式制成薄膜，再经乙醇或水蒸气处理，稳定SF 膜[26-27]。识别表面形貌的伪足转变对引导细胞铺展和迁移起关键作用；除图案化外，其他表面属性在维持内皮细胞的功能中也发挥重要作用。

非热塑性材料虽具有良好的生物相容性，但单一的成分往往难以满足生物组织工程的需求，制备出具有多重功效的复合图案化生物材料尤为关键。SF 适合作为角膜支架的生物材料，大量学者对SF 薄膜支架进行了修饰，如制备β-胡萝卜素/SF 复合膜，溶血磷脂酸/SF 复合膜，甘油（glycerol，Gly）/SF 复合膜，PEG400/Gly/SF/薄膜[28-31]；根据混入材料的特性赋予单一成分之外更多功能，如促进细胞功能表达，增加材料弹性和热稳定性等。此外，Lü 等[32]通过旋涂法在玻片上制备胶原/CS 薄膜，复合膜表现出更优异的亲水性，提高细胞存活率。Ding 等[33]通过加入二醛化聚乙二醇及调整pH 值，将混合溶液转化为水凝胶，开发出用于伤口敷料的自愈性CS-胶原蛋白复合水凝胶。Qian 等[34]制备的富血小板血浆/CS/SF 复合水凝胶，克服了传统富血小板血浆凝胶降解过快的不足，并且保持生物活性分子的可持续释放。Nogueira 等[35]使用水解胶原蛋白、CS、含有磷酸和氯化钾的水溶液、Gly 及纳米羟基磷灰石颗粒，制得共混膜。矿物的存在改善了膜的机械性能、增加表面自由能。Ahmadi 等[36]将明胶、透明质酸溶解混合，并添加载阿托伐他汀的纳米结构脂质载体到溶液中，转移到模具后真空干燥，得到复合纳米薄膜，最后通过旋涂仪在膜的表面涂覆一层薄薄的PCL，PCL 赋予材料的机械性能，明胶和透明质酸提供良好的生物学功能。

上述复合膜的制备简要概括为将所需材料以溶液形式混合，然后浇注于平面上，经过干燥等处理后得到复合膜。那么是否可以在最后一步将溶液浇注于PDMS 基底上，制备出图案化复合膜。但溶剂的挥发是否造成薄膜皱缩、材料之间的物理化学反应等是否对材料表面微形貌的精细复刻产生影响，有待进一步尝试改进研究。

4 总结与展望

生物材料表面图案化的方法大致分为两种，热塑性材料采用熔融浇铸法，将材料以膜状置于PDMS 基底上，加热融化待冷却凝固后即得到图案化材料；非热塑性或熔点较高的材料采用溶液浇注法，将材料以液态浇注于PDMS 基底上，干燥后剥离即可。由于生物材料单一的理化特点难以满足生物组织工程的需求，热塑性与非热塑性材料均可尝试多种成分叠加的复合材料，同时可以借鉴热塑性生物材料表面改性的方法制备具有多重功效的图案化材料。此外，热塑性材料具有优异的机械性能，但其亲水性较差；非热塑性材料具有良好的生物相容性，但其抗压强度和硬度过低。将两种材料进行互补提高综合性能，可以成为未来进一步的改性方向。本文为组织工程开发出既保留原有图案化结构又具有新功能特性的材料提供依据。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。