柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

谢帆 龚顺 王泽琼 肖玉雄 杜志强 仝铸 何秀娟 邱文明 孙中海 潘志勇 肖翠

果蔬園艺作物种质创新与利用全国重点实验室， 武汉 430070; 3. 宜昌三峡百景宜农业科技发展有限公司， 宜昌 443600）

摘要

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害，目前没有可用的有效药剂和抗病品种，分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价，针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因，构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明，使用Es Taq MasterMix对感染 Candidatus Liberibacter asiaticus （CLas）的柑橘样品进行常规PCR检测时，在评价的16对引物中，OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高，推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品；各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系，部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增，F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系，且最高可稳定特异检出105倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-3 ng/μL），是灵敏度最高的引物组，OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-2 ng/μL），是适用扩增体系最广的引物组；构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中，pnrdB83扩增效率最接近100%，且在2次重复试验中波动最小，稳定性最强，并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时，各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小，是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。

关键词

柑橘黄龙病; 常规PCR; 巢式PCR; 绝对定量PCR; 引物评价

中图分类号：

S 436.661.12

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2023396

Molecular detection primer evaluation and absolute quantitative PCR system optimization of Candidatus Liberibacter asiaticus （CLas）

XIE Fan1，2#， GONG Shun1，2#， WANG Zeqiong1， XIAO Yuxiong1， DU Zhiqiang3， TONG Zhu1，HE Xiujuan1， QIU Wenming1， SUN Zhonghai1， PAN Zhiyong2， XIAO Cui1*

（1. Hubei Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization of Fruit Trees， Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy

of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China; 2. National Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization of

Horticultural Crops， College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China;

3. Yichang Three Gorges Baijingyi Agricultural Science and Technology Development Co.， Ltd.， Yichang 443600， China）

Abstract

Citrus Huanglongbing （HLB） is the most devastating disease for the citrus industry. Currently， there are no effective cure and diseaseresistant varieties available. Molecular detection is crucial for the effective prevention and management of Huanglongbing. In this study， we evaluated the commonly and worldwidely employed primers for conventional PCR and nested PCR detection， and constructed plasmid standards based on multiplecopy nrdB and 16S rDNA genes， and then screened the best plasmids suitable for absolute quantitative PCR. The results showed that among the 16 pairs of primers evaluated in this study， OI1/OI2c， Las606/LSS and HLBF468/R877 had the highest sensitivity when using Es Taq MasterMix for conventional PCR detection of Candidatus Liberibacter asiaticus （CLas） infecting citrus samples， which was recommended to detect samples with low CLas titer. Each nested PCR detection primer had their applicable amplification systems， and some primers showed strong nonspecific amplification when amplified with Es Taq MasterMix， while F1/B1→F3/B3 were suitable for Es Taq MasterMix system， and could stably and specifically detect the 105fold diluted citrus total DNA samples （2×10-3 ng/μL） infected with CLas， which was the primer set with the highest sensitivity. OI1/OI2c→S3/S4 could stably and specifically detect 104fold diluted citrus total DNA samples （2×10-2 ng/μL） infected with CLas both in Es Taq MasterMix and Ex Taq DNA polymerase systems， which was the primer set with the widest applicable amplification systems. Among the five plasmid standards constructed for absolute quantitative PCR， pnrdB83 was the best plasmid whose amplification efficiency was closest to 100% and with the least fluctuation and strongest stability between two repeated experiments. Besides， when used pnrdB83 as a standard for absolute quantification of Huanglongbing samples， the copy number difference of each sample between the two repeated experiments is the smallest. The results will provide a reference for qualitative and quantitative molecular detection of CLas.

Key words

citrus Huanglongbing; conventional PCR; nested PCR;  absolute quantitative PCR; primer evaluation

柑橘是世界第一大水果［1］，目前我国柑橘产业规模位居世界首位，产量占世界的1/3左右［2］，是我国南方乡村振兴的支柱产业［3］。柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害，其病原菌是无法在培养基上分离培养的韧皮部杆菌属Candidatus Liberibacter细菌［4］。柑橘受到黄龙病菌侵染后树体长势严重削弱，植株表现叶片斑驳黄化，果实畸形且着色不均等症状［57］，目前没有针对黄龙病的有效药剂和抗病品种［8］，主要通过严格检疫、及时砍除病树、应用无病苗木、防治传播媒介柑橘木虱进行防控［3，910］。

严格检疫和及时砍除病树等黄龙病防控措施均需依靠对黄龙病的准确诊断。黄龙病田间诊断多以叶片斑驳黄化、“红鼻子果”等典型症状作为判断依据，但除结果期的“红鼻子果”外，叶片症状也可能由缺素等引起，故田间诊断只能作为初步判断依据。处于黄龙病潜伏期和早期无症状的柑橘植株，则需要使用更为有效的分子检测进行诊断。常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR是目前各实验室常用的柑橘黄龙病菌分子检测方法。16S rDNA基因、β操纵子（rplKAJLrpoBC）和外膜蛋白基因（OMP）等保守看家基因被作為分子检测靶标广泛用于柑橘黄龙病菌常规PCR和巢式PCR检测的特异引物设计［10］。常规PCR和巢式PCR可以对黄龙病菌进行定性检测，但由于黄龙病菌在柑橘植株体内分布不均，各分子检测所用组织部位不同，引物灵敏度各异，PCR反应受模板DNA质量和浓度、扩增反应体系和程序等影响，易导致同一样品在不同实验室检测结果不一致而出现假阳性或假阴性。相比常规PCR和巢式PCR，定量PCR灵敏度更高，且可对病原菌含量进行定量。Li等以16S rDNA基因为分子靶标，设计了柑橘黄龙病菌亚洲种、非洲种和美洲种特异的荧光定量PCR引物和探针［11］，并建立了绝对定量PCR体系［12］。为了提高检测灵敏度，Zheng等针对具有5个拷贝的nrdB基因设计了RNRf/RNRr引物，检测灵敏度可提高3倍［13］，但基于该引物的qPCR体系仅通过Ct值分析进行黄龙病菌的定量，没有建立相应的绝对定量PCR体系。

本研究固定取样部位和模板DNA浓度，经qPCR检测后，筛选阳性样品DNA并混合为单一黄龙病菌阳性样品，用此样品对国内外常用的常规PCR和巢式PCR分子检测引物进行评价，分别筛选灵敏度高、特异性好、稳定性强的检测引物，为柑橘黄龙病菌常规定性分子检测提供参考。同时针对具有5个拷贝的nrdB基因和3个拷贝16S rDNA基因，分别构建质粒和绝对定量PCR体系并进行评价，筛选适用于定量检测黄龙病菌的最佳质粒及引物，为柑橘黄龙病菌定量分子检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试样品

常规PCR和巢式PCR检测引物评价试验所用柑橘黄龙病阳性样品采集自广西壮族自治区北海市合浦县沙田镇柑橘黄龙病重症果园，品种为‘爱媛28号，植株具有典型黄龙病症状。取植株上黄龙病菌高度富集的主叶脉和叶柄，参考本实验室改良的CTAB法［14］提取样本DNA。用超微量核酸浓度测定仪测定样品DNA浓度，并统一定量至200 ng/μL，用1％琼脂糖凝胶电泳检查DNA浓度定量准确性以及DNA质量。用高灵敏度引物RNRr/RNRf［13］对样品DNA进行qPCR检测，以本实验室人工气候箱中实生播种，经qPCR检测为黄龙病阴性的桃叶橙DNA作为阴性对照，以超纯水作为清水对照，每样品设置3个重复。根据qPCR检测结果，将Ct值≤20，且熔解曲线吸收峰为单峰的样品确定为黄龙病阳性样品，并将这些阳性样品DNA混合，以获得足量单一黄龙病菌阳性样品DNA用于后续试验。

1.2 常规PCR检测引物评价

根据黄龙病菌常规PCR检测相关国内外文献以及国家发明专利，收集了16对PCR检测引物进行比较，引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成（表1）。对上述黄龙病阳性样品DNA进行10倍梯度稀释，取101，102，103，104，105，106，107，108，109倍稀释的黄龙病阳性样品DNA分别作为模板进行常规PCR扩增，以本实验室人工气候箱中实生播种，经qPCR检测为黄龙病阴性的桃叶橙DNA作为阴性对照，以超纯水作为清水对照。反应体系：2×Es Taq MasterMix（Dye）12.5 μＬ，10 μmol/L上、下游引物各1 μＬ，模板DNA 1.25 μＬ，ddH2O补足至总体积25 μＬ。反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，53～67℃退火30 s（各引物退火温度见表1），72℃延伸15～45 s（延伸时间根据各引物扩增片段大小进行调整，各引物扩增片段大小见表1），35个循环；72℃延伸2 min。反应完成后，取10 μL PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳，并于凝胶成像仪中观察拍照。

1.3 巢式PCR检测引物评价

根据黄龙病菌巢式PCR检测相关国内外文献，收集了5组巢式/半巢式PCR检测引物，此外根据βoperon基因序列对P535f/r、P400f/r两对引物序列进行纠正，设计P535CORf/r、P400CORf/r两对引物，引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成（表2）。分别采用Es Taq MasterMix（Dye）和Ex Taq DNA Polymerase（TaKaRa）反应体系进行比较。Es Taq MasterMix（Dye）的反应体系和反应条件参照1.2常规PCR检测。Ex Taq DNA Polymerase（TaKaRa）反应体系：TaKaRa Ex Taq（5 U/μＬ） 0.125 μＬ，10×Ex Taq Buffer（Mg2+ plus）（20 mmol/L） 2.5 μＬ，dNTPs（各2.5 mmol/L） 2 μＬ，10 μmol/L上、下游引物各1 μＬ，模板DNA 1.25 μＬ，ddH2O补足至总体积25 μＬ；反应条件为：98℃变性10 s，53～62℃退火30 s（各引物退火温度见表2），72℃延伸30～60 s（延伸时间根据各引物扩增片段大小进行调整，各引物扩增片段大小见表2），35个循环。两种反应体系第1轮PCR扩增模板为10倍梯度稀释系列（101～109）黄龙病阳性样品DNA、黄龙病阴性对照和清水对照，第2轮PCR扩增模板为第一轮PCR产物的25倍稀释液。反应完成后，取10 μL PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳（TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase PCR产物需加入2 μL 6×Loading buffer混匀后再上样），电泳结束后于凝胶成像仪中观察拍照。

1.4 绝对定量PCR质粒构建及标准曲线建立

围绕具有5个拷贝的nrdB基因以及具有3个拷贝的16S rDNA基因构建质粒。针对nrdB基因设计2对新引物RNRn1f/RNRn1r和RNRn2f/RNRn2r进行PCR扩增，扩增片段大小分别为 83 bp 和113 bp，同时对文献已报道的引物RNRf/RNRr［13］，HLBas/HLBr［1112］，OI1/OI2c［15］进行PCR扩增，扩增片段大小分别为81、76 bp和1 160 bp。将PCR扩增获得的目的片段，经胶回收纯化后，通过TA克隆，克隆到pCloneEZTA（1 865 bp）载体中，挑取阳性克隆经测序确定后获得用于绝对定量PCR的重组质粒，分别命名为pnrdB83（1 948 bp），pnrdB113（1 978 bp），pnrdB81（1 946 bp），p16SrDNA76 （1 941 bp），p16SrDNA1160（3 025 bp），其质粒浓度分别为123.35，118.55，140.25，255.00，121.05 ng/μL。根据公式每微升拷贝数（拷贝/μL）=［质粒浓度（ng/μL）×10-9×6.02×1023］/（质粒DNA长度×660），计算上述质粒的拷贝数，进而计算出质粒拷贝数的对数值分别为10.76，10.74，10.82，11.08，10.56。对上述各质粒进行10倍梯度稀释，取102～107倍梯度稀释的pnrdB83、pnrdB113、pnrdB81质粒DNA分别作为模板进行qPCR扩增，取103～108倍梯度稀释的p16SrDNA76质粒DNA作为模板进行qPCR扩增，取103～107倍梯度稀释的p16SrDNA1160质粒DNA作为模板进行qPCR扩增，以本实验室人工气候箱中实生播种，经qPCR检测为黄龙病阴性的桃叶橙DNA作为阴性对照，以超纯水作为清水对照，设置3孔机械重复，两次重复试验（第2次重复试验将p16SrDNA76质粒稀释为133.85 ng/μL，其质粒拷贝数的对数值为10.80，取102～107倍梯度稀释的质粒DNA作为模板进行qPCR扩增）。pnrdB83，pnrdB113，pnrdB81，p16SrDNA76质粒构建的目的片段扩增引物直接用于它们的qPCR反应，p16SrDNA1160质粒的qPCR反应引物为HLBas/HLBr。qPCR反应体系：2×SYBR Green qPCR Mix（莫纳生物）5μL，10 μmol/L上、下游引物各0.2 μＬ，质粒DNA 1 μＬ，ddH2O补足至总体积10 μＬ。qPCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性10 s，60～62℃退火10 s（各引物退火温度见表3），72℃延伸15 s，40个循环；熔解曲线分析：95℃ 15 s（1.6℃/s），60℃ 1 min（1.6℃/s），95℃ 15 s（0.15 ℃/s）。反应完成后，以质粒拷贝数的对数值为纵坐标（Y），Ct值为横坐标（X），利用Excel进行线性回归分析绘制标准曲线，获得线性回归方程并计算相关系数R2，根据公式（10-斜率-1）计算扩增效率（AE：amplification efficiency）。

1.5 绝对定量PCR体系在田间样品黄龙病菌含量分析中的应用

对实验室前期经常规PCR（引物：OI1/OI2c）和qPCR（引物：RNRf/RNRr）Ct值分析確定的19个黄龙病阳性DNA样品［14］进一步进行绝对定量PCR分析。分别对pnrdB83，pnrdB113，pnrdB81，p16SrDNA76，p16SrDNA1160等5个质粒进行10倍梯度稀释，利用各质粒对应的qPCR引物对各质粒的梯度稀释液和19个黄龙病阳性DNA样品（200 ng/μL）进行qPCR反应，反应体系和反应条件参考1.4，设置3孔机械重复，2次重复试验。反应完成后，以质粒拷贝数的对数值为纵坐标（Y），Ct值为横坐标（X），利用Excel进行线性回归分析绘制标准曲线，获得线性回归方程，将各待测样品的Ct值代入线性回归方程中计算出各待测样品DNA拷贝数的对数值。

2 结果与分析

2.1 常规PCR检测引物特异性和灵敏度比较

以同一黄龙病阳性柑橘总DNA的10倍梯度稀释样品为模板，使用Es Taq MasterMix（Dye）进行PCR扩增，评价本研究收集的柑橘黄龙病菌常规PCR检测引物。结果如图1所示： 1）Hlbsf/Hlbsr有很强的非特异性扩增且不能扩增到目的条带（507 bp），HLBF/R和CalsppsecF/R在阴性对照、清水对照以及所有梯度稀释样品中均能扩增到目的条带，这3对引物不适宜使用Es Taq MasterMix（Dye）进行柑橘黄龙病菌PCR检测。2）其余13对引物中，OI1/OI2c、Las606/LSS、HLBF468/R877灵104倍稀释（浓度为2×101～2×10-2 ng/μL）感染CLas柑橘总DNA样品。 3）引物组OI1/OI2c→S3/S4在两种反应体系中均可稳定特异检出101～104倍稀释（浓度为2×101～2×10-2 ng/μL）样品，用Ex Taq DNA Polymerase进行扩增时偶尔可检出浓度低于2×10-2 ng/μL 的样品。4）引物组fD1/rD1→OI1/OI2c利用Es Taq MasterMix（Dye）进行扩增时最高可稳定特异检出104倍稀释样品（2×10-2 ng/μL），利用Ex Taq DNA聚合酶进行扩增时最高可稳定特异检出103倍稀释样品（2×10-1 ng/μL），偶尔可检出浓度低于2×10-1 ng/μL 的样品。5）引物组F1/B1→F3/B3利用Es Taq MasterMix（Dye）进行扩增时最高可稳定特异检出105倍稀释样品（2×10-3 ng/μL），偶尔可检出浓度低于2×10-3 ng/μL 的样品，利用Ex Taq DNA聚合酶进行扩增时最高可稳定检出104倍稀释样品（2×10-2 ng/μL），但有非特异性扩增条带。

2.3 绝对定量PCR质粒和引物稳定性比较

对构建的质粒经10倍梯度稀释后进行qPCR反应，经2次重复试验获得各质粒的标准曲线和线性回归方程并计算相关系数R2、扩增效率（AE），平均ΔCt值，如表4和图3所示，2次重复试验下，pnrdB81质粒的相关系数分别为0.996 9、0.998 2，扩增效率分别为111.35%、101.28%，平均ΔCt值分别为2.97、3.25；pnrdB83质粒的相关系数分别为0.995 2、0.994，扩增效率分别为99.34%、98.29%，平均ΔCt值分别为3.29、3.26；pnrdB113质粒的相关系数分别为0.995 7、0.991 8，扩增效率分别为105.49%、91.87%，平均ΔCt值分别为3.08、3.69；p16SrDNA76质粒的相关系数分别为0.994 1、0.992 1，扩增效率分别为97.61%、100.26%，平均ΔCt值分别为3.26、3.15；p16SrDNA1160质粒的相关系数分别为0.999 6、0.998，扩增效率分别为66.19%、62.97%，平均ΔCt值分别为4.51、4.75。上述结果表明，p16SrDNA1160质粒的扩增效率未能达到qPCR反应扩增效率范围90%～110%，不适宜用于绝对定量qPCR分析；pnrdB83质粒的扩增效率最接近于理想扩增效率100%，其平均ΔCt值也最接近于理想值3.33，且在2次重复试验下的波动最小，稳定性最强，因此pnrdB83为本研究筛选的最佳质粒。

敏度最高，最高可检出104倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-2 ng/μL）；Omp1218f/2026r、16sf/16sr最高可检出103倍稀释样品（2×10-1 ng/μL）；UP2/DP2、CQULA03F/03R、SEQIDNO.1/NO.2最高可检出102倍稀释样品（2×100 ng/μL）；P1/P2、P535f/r、OI2/23S1最高可检出的稀释倍数虽然为102，但102倍稀释样品（2×100 ng/μL）扩增条带微弱；S3/S4、A2/J5最高可检出的稀释倍数虽然为102，但能扩增出非特异条带且102倍稀释样品（2×100 ng/μL）扩增条带微弱；因此13对引物的灵敏度由高到低依次为：OI1/OI2c=Las606/LSS=HLBF468/R877＞Omp1218f/2026r=16sf/16sr＞UP2/DP2=CQULA03F/03R=SEQIDNO.1/NO.2＞P1/P2=P535f/r=OI2/23S1＞S3/S4=A2/J5。

2.2 巢式PCR检测引物特异性和灵敏度比较

以同一黄龙病阳性柑橘总DNA的10倍梯度稀释样品为模板，使用Es Taq MasterMix（Dye）和Ex Taq DNA Polymerase分别进行PCR扩增，评价本研究收集的柑橘黄龙病菌巢式PCR检测引物。结果如图2所示：1）A2/J5→A2/J5n这一组引物用两种反应体系进行扩增，均在阴性对照、清水对照以及所有梯度稀释样品中扩增到目的条带，因此不适宜用本研究的柑橘黄龙病菌巢式PCR检测体系。2）引物组P535CORf/r→P400CORf/r以及P535f/r→P400f/r不宜使用Es Taq MasterMix（Dye）进行扩增（阴性对照、清水对照以及所有梯度

2.4 绝对定量PCR体系在田间样品黄龙病菌含量分析中的比较

利用实验室前期鉴定到的19个黄龙病阳性柑橘DNA样品对5个质粒的绝对定量分析效果进行比较，根据2次重复试验结果，如表5所示，以pnrdB81质粒作为标准品制作标准曲线计算各样品拷贝数，2次重复试验之间样品拷贝数最大差值为4.14，最小差值为2.93；以pnrdB83质粒作为标准品，样品拷贝数最大差值为0.88，最小差值为0.83；以pnrdB113质粒作为标准品，样品拷贝数最大差值为4.32，最小差值为2.61；以p16SrDNA76质粒作为标准品，样品拷贝数最大差值为4.38，最小差值为4.05；以p16SrDNA1160質粒作为标准品，样品拷贝数最大差值为1.37，最小差值为1.22；上述结果表明用pnrdB83质粒作为标准品对待测样品中黄龙病菌含量进行定量分析的稳定性最强，因此pnrdB83为本研究筛选的最佳质粒。

3 结论与讨论

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害，目前没有可用的有效药剂和抗病品种，通过分子检测进行黄龙病诊断对黄龙病有效防控至关重要。本研究利用同一黄龙病阳性柑橘样品DNA，在高效便捷且价格低廉的Es Taq MasterMix体系中，对16对常规PCR检测引物进行了评价。Las606/LSS和HLBF468/R877是研究人员设计的用于常规PCR的高灵敏度新引物［1617］。梁亮等［17］研究表明感染黄龙病菌的柑橘叶片DNA稀释103倍，引物HLBF468/R877仍然可以扩增出特异性条带，在本研究中该引物不仅可对103倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-1 ng/μL）扩增出明亮条带，还可对104倍稀释样品（2×10-2 ng/μL）扩增出微弱条带，说明该引物的灵敏度确实高，同时利用本研究的扩增体系可将该引物的灵敏度提高10倍。Fujikawa 等［16］研究表明对田间样品进行检测时，Las606/LSS检出的黄龙病阳性率高于使用OI1/OI2c检测，且对某些样品Las606/LSS仅用微量DNA模板即可检出黄龙病菌，OI1/OI2c则不能检出。在本研究中，OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877虽然均可检出104倍稀释样品（2×10-2 ng/μL），但OI1/OI2c对103倍稀释样品（2×10-1 ng/μL）扩增条带微弱，而Las606/LSS和HLBF468/R877对103倍稀释样品（2×10-1 ng/μL）进行扩增时，条带仍然非常明亮；以此来看，针对病原菌含量低的样品，使用Las606/LSS和HLBF468/R877的检出可能性可能比使用OI1/OI2c高，因此针对田间病原菌含量低的样品，利用常规PCR进行检测时，为了避免漏检，建议同时使用OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877进行检测。相比16S rDNA基因在黄龙病菌亚洲种和非洲种之间高达97.5%的同源性，外膜蛋白OMP基因和β操纵子rplAJ位点在亚洲种和非洲种之间的同源性只有78.4%和70%，因此这2个基因除了可用于常规PCR检测外，还可用于黄龙病菌的分子分型检测［18］。基于OMP基因的Omp1218f/2026r引物在本研究中的检测灵敏度仅次于前3对引物，Deng等［18］还根据其在不同菌系之间的SNPs，对源自柚子上的黄龙病菌菌系进行了分型分析。基于rplAJ位点的A2/J5引物可根据扩增片段大小不同区分亚洲种（703 bp）和非洲种（669 bp），且该引物可检测稀释103倍的黄龙病感病柑橘样品DNA［27］，但在本研究中该引物仅可在稀释101～102倍的感病柑橘样品DNA中扩增到微弱的703 bp条带，且伴随一条500 bp左右的非特异扩增条带，结果不一致的原因可能是本研究所用扩增体系与Hocquellet等［27］的体系不同。CalsppsecF/R、HLBF/R、Hlbsf/Hlbsr等引物也因其非特异性扩增，不适宜使用本研究的常规PCR扩增体系。

通常巢式PCR的灵敏度较常规PCR高，因此针对田间病原菌含量低的样品，使用巢式PCR可以提高检出率。本研究利用同一黄龙病阳性柑橘样品DNA，对6组巢式PCR检测引物进行了评价。本研究常规PCR大部分引物仅可检出102倍以内稀释样品，但巢式PCR引物，除A2/J5→A2/J5n外，其他引物至少在一种适用体系中可稳定特异检出104倍以内稀释样品，少数引物组还可检出105倍稀释样品，说明巢式PCR比常规PCR灵敏度高102～103倍。本研究常规PCR中引物灵敏度最高的OI1/OI2c虽然可检出稀释104倍的样品，但稀释103～104倍以后的样品扩增条带微弱；S3/S4引物经常规PCR仅可检出102倍以内稀释样品，且扩增条带微弱；但以OI1/OI2c作为第1轮PCR引物，以S3/S4作为第2轮PCR引物的巢式PCR，在Es Taq MasterMix和TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释样品，且扩增条带明亮；说明此巢式PCR体系比常规PCR灵敏度至少高100倍。根据本研究巢式PCR的结果发现，不同巢式PCR引物组适用的扩增体系不同，需要根据引物组选择合适的扩增体系。本研究利用A2/J5引物进行常规PCR时有非特异性扩增，利用A2/J5→A2/J5n进行半巢式PCR扩增时，不论Es Taq MasterMix还是Ex Taq DNA聚合酶体系，均出现非特异性扩增，该引物不适宜使用本研究的扩增体系。此外，我们对丁芳等［24］设计的P535f/r→P400f/r引物组与黄龙病菌基因组进行比对时，发现引物序列有多处碱基错误，因此对其进行了修正，设计了修正引物组，但结果表明2组引物均不适宜用Es Taq MasterMix体系，在Ex Taq DNA聚合酶体系中两者灵敏度相当。

常规PCR和巢式PCR仅能对黄龙病菌的有无进行定性判断，定量PCR不仅灵敏度高，可以对早期病原菌含量低的样品进行检测，而且可对黄龙病菌的含量进行定量分析。为了进一步提高检测灵敏度，研究人员基于多拷贝基因位点开发了高灵敏度定量PCR引物RNRf/RNRr［13］和4CPf/4CPr［32］，并進一步研发了基于双引物的双重定量PCR检测方法［33］，但这些研究均仅通过Ct值分析进行黄龙病诊断，没有进一步开发基于高灵敏度引物的绝对定量PCR体系。由于不同批次的qPCR反应，即便同一样品，其Ct值也经常会出现系统性的波动，同一批次内的qPCR反应也会因样品初始模板量不同而导致Ct值不可比较，因此通过Ct值分析做不到精准定量分析，而基于标准质粒的绝对定量PCR，可在不同批次上利用同一标准质粒作为内标构建标准曲线，进而通过线性回归方程计算待测样品病原菌含量，从而剔除qPCR反应在不同批次之间的系统误差而做到精准定量分析，因此标准质粒在不同批次之间的扩增稳定性直接影响绝对定量PCR分析的准确度。本研究针对具有5个拷贝的nrdB基因，分别构建了标准质粒pnrdB81、pnrdB83和pnrdB113，同时针对具有3个拷贝的16S rDNA基因，分别构建了标准质粒p16SrDNA76和p16SrDNA1160，并对上述5个标准质粒在不同批次之间的稳定性进行了评价。根据本研究的结果，影响质粒和引物稳定性的核心因素为质粒和引物的扩增效率，2次重复试验中，pnrdB83质粒扩增效率最接近100%，且波动最小，稳定性最强，因此用于田间样品含量分析时，样品拷贝数差值也最小；而pnrdB81、pnrdB113、p16SrDNA76质粒的扩增效率波动相对大，稳定性相对弱，因此用于田间样品含量分析时，样品拷贝数差值也相对大；p16SrDNA1160质粒的扩增效率虽然波动较小，用于田间样品含量分析时样品拷贝数差值也相对小，但是该质粒扩增效率极低（66.19%、62.97%），未达到qPCR反应扩增效率范围（90%～110%），原因可能是该质粒为长片段质粒。此外基于同一基因nrdB构建的3个质粒（pnrdB83、pnrdB81、pnrdB113）稳定性存在差异，其可能的原因是pnrdB81在扩增片段上游多出9 bp序列且在另一位点存在1个SNP，pnrdB113在扩增片段上游多出3 bp序列，且该序列包含1个SNP，而pnrdB83的扩增片段与目的基因片段100%匹配。综上，以pnrdB83质粒作为标准品，以RNRn1f/RNRn1r进行定量PCR的体系为本研究中最稳定的绝对定量PCR体系，可应用于需要进行黄龙病病原菌含量测定和比较的各项试验。

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（责任编辑：田 喆）