高科技组织培养技术及草莓组织培养研究

邢小英

草莓为多年生草本植物，利用细胞工程技术，使用草莓茎尖、花药、叶片等进行组织培养，能实现草莓的快速繁殖。所培育出来的幼苗，产量也比一般繁殖方法多一成以上。笔者在概述植物组织培养的基础上，梳理了草莓组织培养的常用途径和常见问题及对策。

1 植物组织培养概述

1.1 植物组织培养的概念

植物组织培养是利用植物细胞全能性原理，在无菌条件下，将离体茎或叶的表皮、叶脉、幼嫩茎或芽组织（如芽、胚轴等）用无菌水清洗，然后接种到培养基上，利用细胞分裂增殖、组织分化和器官形成等机制来生产植株的过程。植物组织培养是20世纪60年代中期在生物技术领域中发展起来的一项新兴技术，是生物技术与现代生物学结合的产物。在植物组织培养过程中，离体培养可以得到大量的变异植株，获得大量优良品种，进行遗传育种和细胞工程研究。组织培养也可用于植物转基因、基因转移、细胞融合等研究，并已成为一种重要的基因工程手段（图1）。

1.2 植物组织培养过程中的基本要素

植物组织培养的基本要素主要包括外植体的选择与消毒、培养基的配制、生长调节剂的选择与使用以及无菌操作等。外植体选择是组织培养成功的关键因素。应根据植物的种类、组织或器官、胚状体或种子、器官的大小等，从生理状态和形态结构上进行选择。无菌操作是组织培养成功的关键。严格按照无菌操作规程进行组织培养是成功的前提。培养基配制也是关键要素之一。根据外植体选择相应类型的培养基，同时要注意培养基中各种成分的配比，其中糖、无机盐、有机化合物、水是基本培养基。还要注意选择合适的激素浓度。生长调节剂使用也是影响植物组织培养的重要方面。要根据外植体和培养基类型正确使用生长调节剂。

1.3 影响植物组织培养的因素

一是培养基。培养基是由基本培养基、附加成分组成。基本培养基包括基础营养物质和基本生长因子，基础营养物质有无机盐类，如 NaCl、 KCl；有机成分主要为糖类或氨基酸等，如蔗糖、麦芽糖等。辅助因子主要包括植物激素和生长调节剂，常用的辅助因子有：6- BA和 IAA，常用的基本培养基为 MS和B5。

二是灭菌方法。常用的灭菌方法有高温灭菌法、高压灭菌法及微波灭菌法等（图2）。

三是接种材料。不同的材料生长状态也不同，通常以愈伤组织为主，而植物材料的种类也影响到植物组织的类型，如水稻叶、水稻茎等；此外，接种材料对植物组织培养结果也有一定影响，如接种材料是茎，则茎段能发育成愈伤组织；接种材料是根，则根能发育成植株等。

四是温度和光照。不同植物对温度的要求不同，一般在25～28 ℃最为适宜；光强度对植物的影响较大，在光照度大于3000 勒克斯时，植物生长良好；在低光照度下，植物生长慢；在弱光下，植物生长快。因此在组织培养中应尽量提高光照度。

五是碳源和氮源。碳源通常包括蔗糖、葡萄糖、乳糖等；氮源有尿素和硝酸銨等。培养基中的碳源和氮源的比例也很重要。一般是碳水化合物占80%～90%，氮源占10%～20%；培养基中蔗糖含量不低于30克/升。

六是细胞分裂素和生长素。他们对芽的形成有很大影响，因此在组织培养过程中必须注意这些因素对细胞分裂的影响。

此外，其他因素如培养基 pH值、盐浓度等也会影响植物组织培养的效果。

1.4 植物组织培养的技术要点

植物组织培养是一个复杂又精细的过程，在整个过程中存在着一系列技术问题需要解决，主要包括植物材料的选择与处理、接种培养基的配制与灭菌、腋芽诱导与增殖、生根培养、移栽和管理方法等。

1.4.1 植物材料的选择与处理 植物组织培养所使用的外植体必须是新鲜、完整、没有病虫危害及死亡、没有损伤和发育异常的植株。通常将带有腋芽或刚长出腋芽不久的茎段剪下，作为外植体。

1.4.2 培养基的配制 必须使用无菌手术操作时所用的无菌材料，如无菌操作器械、剪刀、手术刀等。灭菌要严格按照无菌操作原则进行，以保证所使用培养基中不带有细菌和其他微生物。

1.4.3 腋芽诱导 腋芽是茎顶端分生组织中新生出来的一种小芽。这种芽可以在离体条件下分化成完整植株，而不会受到其他外界条件和内源激素的影响。将植物材料（外植体）在培养基上进行培养时，往往会产生大量不定芽，如不定根、不定茎等，这些不定芽称为腋芽。在培养基中进行腋芽诱导时，要注意尽量少用激素，这样才能诱导出较多的腋芽。腋芽诱导一般需要6～7天。

1.4.4 生根培养 当腋芽增殖到一定数量时，就可以把这些腋芽从培养基中转移到生根培养基中。

2 草莓的组织培养技术

通过茎尖、花药等部分的培养，可以有效地去除大部分植物体内的病毒、真菌和细菌，从而促进生长势、丰富花色多样性、增强抗逆性和提高产量[1]。按照采集、接种、培养、生根、移栽的流程，实现了工厂化生产，该技术在反季节生产中发挥了独特的作用。草莓的组织培养有利于草莓优良性状的保持，促进产量和品质的提高等（图3）[2]。

2.1 草莓组织培养影响因素

2.1.1 外植体材料的选择 组织器官的不同，组培后代的变异程度也不同。草莓的子叶是草莓最重要的器官，草莓的生长、发育和花芽分化都与子叶密切相关，同时也是草莓繁殖的主要器官。匍匐茎是草莓植株基部萌发并生长出来的一段茎，在组织培养中，一般把它作为外植体，因为它很容易长出根，且生出的根多为匍匐茎。匍匐茎顶端一般有一对叶片和一朵小花。当它产生不定芽时，将它从植株基部切下，成为外植体，并在培养基中培养。根尖是草莓根部的一个小分支，位于植物中央的最深部分，是草莓组织培养中的重要外植体。茎尖是在茎基或芽上方0.5～1.0 厘米处剪取的一段，常用来作为草莓组织培养的外植体。通常认为，在一定浓度的激素作用下，高度分化的组织或细胞可以获得愈伤组织，并通过继代培养获得再生植株。含有分生组织的外植体，如茎尖、腋芽等，其分化率比叶片、根段、茎等的要低[3]。

2.1.2 培养基成分 在草莓的组织培养过程中，培养基中激素的种类、浓度和组合与无性系变异有关，尤其是细胞分裂素的浓度过高是组培苗发生变异的重要原因之一。细胞分裂素可以通过诱导和抑制植株的生长，影响植株的形态和发育，从而影响植物的产量和品质[4]。另外，细胞分裂素也可以影响植物的抗氧化能力、抗病虫害能力以及抗环境胁迫能力等，从而影响植物的生长发育和产量。

2.1.3 继代次数和增殖率 无性系变异与继代次数有着密切的关系，继代次数越多，发生变异的频率就越高。这是因为在一般情况下，遗传变异是由多个基因突变而引起的，而基因突变又可以通过不断地继代来积累。在草莓组织培养实际应用中，应将继代次数控制在10以内，以达到生产标准，继代次数超过30将严重影响草莓果实的产量与品质。

2.2 草莓组织培养的常用途径

2.2.1 草莓茎尖组织培养[5] 有以下技术环节：

（1）取材：以匍匐茎为外植体，将其剪成5～10 厘米长的小段，要求尽量取嫩的小段，并保证茎尖在培养基上分布均匀，且生长良好。取材可在植株开始发生匍匐茎时进行。

（2）接种：将茎尖从基部剪下后，在无菌条件下进行处理，切成5～10 厘米长的小段，消毒2～3次，接种在 MS+0.5 毫克/升6-BA+ 0.2 毫克/升NAA培养基上（图4）。

（3）培养：将培养基置于培养室或温室内，注意室内温度保持在18～25 ℃，相对湿度保持在90%以上。利用该设备对茎尖进行继代培养。一般1个月后形成愈伤组织，再30天后分化出不定芽，再约2周后分化出小苗。

（4）炼苗：将不定芽接种到生根培养基上后进行炼苗。将试管苗转移到暗室内3～5天，然后转入露地中炼苗3～5天。当试管苗在0.5 毫克/升6-BA+0.1 毫克/升 NAA培养基上生长良好后转入生根培养基中进行移栽。

（5）移栽：将试管苗移栽到营养土中，并浇透水。

（6）定植：在温室内定植。定植前需对温室内进行消毒处理，可用5%的次氯酸钠溶液或0.2%的高锰酸钾溶液消毒15 ～30 分钟；或用75%酒精浸泡10～15秒；也可用1毫克/升的升汞溶液浸泡10 ～15 分钟；也可用0.5%过氧乙酸溶液消毒30 ～45 分钟。

（7）采集时间一般在12月中下旬，可从匍匐茎上剪取茎尖。

2.2.2 草莓花药组织培养[6] 有以下技术环节：

（1）材料：选取当年新抽发的花芽，要求无病虫害，花瓣均匀，花药饱满。

（2）采集：将花序從植株上剪下，注意剪去花梗处的腋芽和果实。把花瓣取下来，用酒精浸泡消毒20 ～30 分钟。然后在无菌条件下用镊子将花药夹出，放在超净工作台的载物台上，用镊子取下花药。

（3）接种：将处理好的花药置于 MS培养基上，并添加2～3毫克/升的6- BA和0.2毫克/升的NAA。培养室温度为25～28 ℃，相对湿度为90%左右。

（4）培养：将花药放入接种瓶中，每隔2～3天更换1次培养基。一般每30天左右便可形成愈伤组织并分化出不定芽。在愈伤组织分化过程中，需要适当地补充水分和养分，培养室温度为18～25 ℃。

（5）炼苗：将愈伤组织转移到生根培养基上进行生根培养，当有1～2片新叶长出时即可移栽到大棚内进行炼苗。

（6）移栽：在温室内炼苗3～5天后便可移栽到露地中。当秧苗生长健壮后便可移栽到营养土中进行大田管理。

2.2.3 草莓叶片组织培养 有以下技术环节：

（1）取材：从植株上剪下健康无病虫害的新叶，将其在无菌条件下进行处理，并切成1厘米左右的小段。

（2）接种：将处理好的花药放在适宜的培养基上进行继代培养。

（3）培养：将花药接种到叶片再生培养基上后进行继代培养，30天左右便可形成愈伤组织；随后在不添加任何激素的情况下进行生根培养，30天左右便可形成不定芽；然后转移到生根培养基上进行移栽[7]。

2.3 草莓组织培养中常见的问题与对策

2.3.1 褐化问题 在草莓组织培养中，褐化是常见问题之一。接种后7天内草莓叶柄褐变不明显，7天后，部分较弱的外植体可能发生褐变。随着时间的推移，会有一些外植体出现死亡，而死亡的外植体会出现更加严重的褐化现象[8]。研究表明，褐变主要是由酚类物质氧化导致，酚类物质在酚类物质氧化酶的催化下生成喹诺酮类物质。通过添加抗氧化剂和吸收剂，可以有效地抑制喹诺酮类化合物的形成。维生素C在植物组培苗中也被广泛应用，是一种抗褐变的物质。采用过滤法向培养基中添加维生素C，可显著抑制茎尖褐变，但操作费时费力[9]。用维生素C溶液浸泡草莓芽，300 毫克/升维生素C溶液可明显抑制茎尖褐变，促进外植体形成愈伤组织，并显著提高萌发率。用维生素C浸泡9 分钟后，褐变率较对照组明显降低，说明褐变只会在一定时间内被浸泡后停止。另外，PVV-抗氧化剂能显著降低草莓茎尖褐变率，并能促进愈伤组织生长，其萌发率可达100%。而添加活性炭则不会对褐变产生显著影响。已有研究表明，用维生素C浸泡草莓芽苗，中间添加抗氧化剂 PVP，能显著抑制芽苗褐变，并促进愈伤组织的萌发[10]。

2.3.2 玻璃化问题 在组织培养过程中，玻璃化种苗保存是另一项很难完成的任务，王桂荣[11]的研究表明，玻璃化种苗保存与培养基种类及实验室通气性有关。在组织培养时，愈伤组织吸水较少，提高光照度，有利于叶绿素的合成，尽量使用固体培养基。玻璃化程度较高的植物，细胞分裂速度较快，可加入适量的赤霉素，以减缓细胞分裂速度。王爱勤等[12]对玻璃化幼苗进行了研究，结果表明：随着外植体灭菌和培养时间的延长，糖、琼脂浓度下降，细胞分裂素浓度提高，进而使玻璃化幼苗的数量增加。

2.3.3 污染问题 在组织培养中，如果不能采取有效的防治措施，很容易造成污染问题。造成污染的原因有：真菌、霉菌、细菌和病毒等微生物，它们的繁殖速度很快，分布很广，很难处理。操作人员应注意工作台、培养瓶和培养箱的卫生状况，应经常擦拭，并及时保持干燥。各种真菌和孢子随风飘散，也是大气污染的一个重要污染源。要经常通风，减少室内真菌的积聚。在操作开始之前，一定要做好消毒工作，消毒之后，不能与任何东西接触，要马上去无菌区，进行相关的操作。

3 结 语

植物组织培养是一项在生物技术领域中发展起来的新型技术，它在花卉、蔬菜、果树、林木、药材及牧草等植物育种和工农业生产中有着广泛的应用。开展草莓组织培养，可以有效地实现草莓品种的优良性状保持，防止品种退化，从而提高繁殖系数，缓解草莓种苗供需矛盾，促进草莓产业发展。

参考文献

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[2] 马继文.草莓组织培养及组培苗移栽技术[J].农业工程技术，2019，39（32）：49.

[3] 郭月玲，解振强，王永平.我国草莓组织培养生产研究现状及前景[J].浙江农业科学，2010（6）：1211-1215.

[4] 张玉君，彭兴龙，张哲民，等.草莓组织培养与脱毒技术[J].河南林业科技，2009，29（1）：73-75.

[5] 蒲忠贵，张庆全.草莓茎尖组织培养技术研究[J].甘肃农业科技，2022，53（9）：86-89.

[6] 郭春沅.草莓花药组织培养快速繁殖[J].技术与市场，2000（7）：28.

[7] 王建湘. 草莓组织培养叶片再生技术研究[D].长沙：湖南农业大学，2004.

[8] 潘忠强，尹涛，邵阳，等.现阶段草莓茎尖组织培养防褐化分析[J].农业开发与装备，2021（10）：175-176.

[9] 戴莹，杨世海，赵鸿峥，等.药用植物组织培养中褐化现象的研究进展[J].中草药，2016，47（2）：344-351.

[10] 张清凤，李啟菊，马梅见，等.植物组织培养中的常见问题及对策[J].现代园艺，2022，45（10）：177-179.

[11] 王桂荣.植物组织培养中的常见问题与对策[J].宿州学院学报，2010，25（11）：54-57.

[12] 王爱勤，何龙飞，裴润梅，等.组培条件对不同品种芦荟试管苗玻璃化的影响[J].中国农学通报，2002，18（5）：46-48.