高效液相色谱法测定复方磺胺嘧啶粉(水产用)中磺胺嘧啶和甲氧苄啶含量

李应超,高 婷,王亚芳,孙 丹,周艳飞,杜继红,巩 浩,王 旭,张小飞*

(1.北京市兽药饲料监测中心,北京 102299;2.北京生泰尔科技股份有限公司,北京 102600)

磺胺类药物(sulfonamides,SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称,它通过抑制叶酸的合成而抑制细菌的生长繁殖,从而对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及一些原生生物具有抑制作用[1]。复方磺胺嘧啶粉(水产用)是磺胺嘧啶和甲氧苄啶的复方制剂,临床主要用于治疗草、鲢、鲈、石斑鱼等由气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血性弧菌、鳗弧菌引起的出血症、赤皮病、肠炎、腐皮病等疾病[2]。该制剂现行质量标准现收录于《兽药质量标准》(2017年版)化学药品卷中,其磺胺嘧啶含量测定是利用重氮化反应原理进行定量测定。该方法存在唯一性和目标性较差,难以区分“此磺胺非彼磺胺”,而该种“以此代彼”现象在兽药非法添加物风险监测中被曾发现。甲氧苄啶含量测定采用紫外分光光度法,但该方法在目标物提取的过程中运用较大量的三氯甲烷多次萃取,其存在“三致”危害及环保性差的缺点。目前,磺胺类药物的检测方法主要有液相色谱-串联质谱法[3-5]、液相色谱法[6-7]、酶联免疫法[8-9]、胶体金免疫层析法[10-11],但未见高效液相色谱法测定复方磺胺嘧啶粉(水产用)的报道。基于以上原因,本研究建立了同时测定磺胺嘧啶和甲氧苄啶含量的高效液相色谱方法,为复方磺胺嘧啶粉(水产用)质量标准的提高及产品质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 复方磺胺嘧啶粉(水产用)(100 g:磺胺嘧啶16 g+甲氧苄啶3.2 g),批号为202109251和20210601,分别是北京市和山西省兽药生产企业的产品。

1.1.2 主要试剂 磺胺嘧啶对照品(批号:H0361504,含量99.5%)、甲氧苄啶对照品(批号:H0161704,含量99.8%),中国兽医药品监察所产品。

1.1.3 主要仪器 Waters 2695-2489高效液相色谱仪,Waters Symmetry C18 5 μm 4.6×150 mm色谱柱(色谱柱A),沃特世公司产品;Agilent Extend C18 5 μm 4.6×250 mm(色谱柱B)色谱柱,安捷伦科技有限公司产品;Dikma Silversil C18 5 μm 4.6×250 mm(色谱柱C)色谱柱,迪马科技公司产品。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以水-乙腈-三乙胺(799∶200∶1)(用冰醋酸调节pH至5.9)为流动相,检测波长为240 nm,进样量10 μL。理论板数按甲氧苄啶峰计算不低于4 000,磺胺嘧啶与甲氧苄啶峰的分离度应符合要求。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 供试品溶媒考察 取复方磺胺嘧啶粉适量(约相当于磺胺嘧啶0.1 g),精密称定,置100 mL量瓶中,分别加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液5、10、15 mL及适量流动相,超声30 min,用流动相稀释至刻度,摇匀,滤过;取续滤液5 mL,置50 mL量瓶,用流动相稀释至刻度,摇匀。取10 μL注入液相色谱仪,记录色谱图。

1.2.2.2 供试品超声时间考察 取复方磺胺嘧啶粉适量(约相当于磺胺嘧啶0.1 g),置100 mL量瓶中,加入10 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液及适量流动相分别超声10、20、30 min,用流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 mL,置50 mL量瓶,用流动相稀释至刻度,摇匀。取10 μL注入色谱仪,记录色谱图。

1.2.2.3 溶液制备

(1)供试品溶液的制备:取本品适量(约相当于磺胺嘧啶0.1 g),精密称定,置100 mL量瓶中,加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL和适量流动相超声20 min,用流动相稀释至刻度,摇匀,滤过;精密量取续滤液5 mL,置50 mL量瓶,用流动相稀释至刻度,摇匀。

(2)磺胺嘧啶对照品储备液:取磺胺嘧啶对照品50 mg,精密称定,置50 mL量瓶中,加20 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液及流动相溶解制成1 000 μg/mL的溶液。

(3)甲氧苄啶对照品储备液:取甲氧苄啶对照品20 mg,精密称定,置100 mL量瓶中,加流动相制成200 μg/mL的溶液。

(4)混合对照品溶液:分别精密量取磺胺嘧啶对照品储备液溶液和甲氧苄啶对照品储备液溶液5 mL,至50 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀(1 mL约含磺胺嘧啶100 μg,甲氧苄啶20 μg的混合对照品溶液)。

1.2.3 方法学研究

1.2.3.1 系统适用性与专属性 取混合对照品溶液和供试品溶液,按1.2.1的色谱条件进样检测,分别记录色谱图,计算拖尾因子、理论塔板数、磺胺嘧啶与甲氧苄啶两主峰及与相邻的分离度,考察该方法的系统适应性及专属性。

1.2.3.2 线性考察 分别取磺胺嘧啶储备液5 mL置200、100、50、25 mL量瓶,分别取甲氧苄啶储备液5 mL置同一量瓶,加流动相制成磺胺嘧啶+甲氧苄啶为25 μg/mL+5 μg/mL、50 μg/mL+10 μg/mL、100 μg/mL+20 μg/mL、200 μg/mL+40 μg/mL的混合对照品溶液;取磺胺嘧啶储备液10 mL置25 mL量瓶,取甲氧苄啶储备液10 mL置同一量瓶,加流动相制成磺胺嘧啶+甲氧苄啶为400 μg/mL+80 μg/mL的混合对照品溶液。按1.2.1项色谱条件进行测定,以外标法峰面积计算。

1.2.3.3 精密度 取磺胺嘧啶和甲氧苄啶混合对照品溶液,按1.2.1项色谱条件进行连续进样6次,测定其峰面积,以考察方法的稳定性和准确性。

1.2.3.4 准确度 按照样品规格主成分含量的80%、100%和100%的关系分别加取复方磺胺嘧啶粉0.625 g(约相当于磺胺嘧啶0.1 g),置100 mL量瓶,分别加入80、100、120 mg磺胺嘧啶对照品,再分别精密加入16、20、24 mg的甲氧苄啶对照品至于同一量瓶,按1.2.2.1项方法稀释,制成样品主成分含量的80%、100%和120%的添加回收溶液,每个浓度制备3份平行样,按1.2.1色谱条件进行测定。

1.2.3.5 溶液稳定性 按1.2.2.1项下配制供试品溶液,分别在0、3、6、9、12、18、24 h进样10 μL,记录色谱图,测定峰面积,考察样品的稳定性。

1.2.3.6 耐用性 按按1.2.2.1项下配制供试品溶液,分别调整流动相pH(5.4、5.9、6.4)、柱温(25、30、35 ℃)、流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)、流动相比例和色谱柱进行测定,以考察方法的耐用性。

1.2.3.7 样品含量测定 取收集的样品,按以上确定方法测定复方磺胺嘧啶粉(水产用)中磺胺嘧啶和甲氧苄啶的含量。

2 结果

2.1 供试品溶媒与超声时间考察

当0.1 mol/L氢氧化钠溶液加入量不小于10 mL时,磺胺嘧啶和甲氧苄啶2个主峰峰面积无明显差异;当0.1 mol/L氢氧化钠溶液加入量为10 mL时,样品超声处理20 min以上磺胺嘧啶峰和甲氧苄啶峰面积无明显差异。因此,本方法确定在样品配制中,加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液不应小于10 mL,超声时间不应小于20 min,才能保证样品主成分的完全溶解。结果见表1和表2。

表1 不同提取溶剂下2种成分的测定结果

表2 不同超声时间对2种成分测定结果的影响

2.2 方法学研究

2.2.1 系统适用性试验与专属性 在规定的色谱条件下,系统适用性试验与专属性色谱图见图1。结果显示混合对照品溶液中磺胺嘧啶和甲氧苄啶色谱峰的保留时间分别为5.37 min和5.75 min,其分离度为1.72;供试品溶液的色谱图中两主峰的保留时间与混合对照品溶液中两主峰保留时间一致;空白溶剂的色谱图中,在磺胺嘧啶与甲氧苄啶保留时间处均无干扰,表明其他成分对二者的测定均不会造成影响。

A.空白样品溶液;B.混合对照品溶液;C.供试品溶液

2.2.2 线性关系试验 线性关系结果显示,磺胺嘧啶在25～400 μg/mL浓度范围内,回归方程为y=22 008x+1 083.9,R2=1;甲氧苄啶在5～80 μg/mL浓度范围内y=33 088x-2 954.7,R2=1,表明2种成分在以上范围内具有良好的线性关系(图2)。

A.磺胺嘧啶;B.甲氧苄啶

2.2.3 精密度试验 试验结果见表3,其混合对照品溶液连续进样6次,其2种成分峰面积的RSD分别为0.2%和0.5%,远小于2.0%的要求,表明本方法的重现性良好。

表3 精密度试验结果

2.2.4 添加回收率试验 磺胺嘧啶和甲氧苄啶添加回收率见表4。磺胺嘧啶的回收率在99.20%～101.88%之间,平均回收率为101.01%,批间变异系数为0.5%;甲氧苄啶的回收率为97.83%～101.95%,平均回收率为100.44%,批间变异系数为1.2%,表明本方法回收率良好,准确度高,能够满足检测的需求。

表4 加样回收率试验结果(n=9)

2.2.5 稳定性试验 样品在24 h范围内测得2种成分峰面积无明显变化,RSD分别为0.30%和0.20%,表明该样品溶液稳定性良好,在24 h完成检测,不影响其测定结果。结果见表5。

表5 样品溶液稳定性试验结果

2.2.6 耐用性试验 测定同一供试品的含量,对方法耐用性试验5个考察因素分别进行了考察,其样品中磺胺嘧啶和甲氧苄啶含量测定结果的RSD%分别为0.20%和0.31%(流动相pH)、0.20%和0.31%、0.21%和0.31%、0.24%和0.25%、0.27%和0.29%;分离度均大于1.5,表明流动相pH、柱温、流速、流动相比例和色谱柱在此等条件下对样品含量测定结果影响不显著,表明建立的方法具有良好的耐用性,结果见表6～表10。

表6 不同pH流动相对检测结果的影响

表7 不同柱温对检测结果的影响

表8 不同流速对检测结果的影响

表9 不同流动相比例对检测结果的影响

表10 不同色谱柱对检测结果的影响

2.2.7 样品含量测定 取收集2批样品,按以上确定方法测定含量,磺胺嘧啶、甲氧苄啶两成分的含量分别为标示量的101.1%和96.4%(202109251)、102.9%和100.4%(20210601)。

3 讨论

高效液相色谱法是药物有效成分测定及质量标准建立的重要分析手段,在各国药典中得到广泛应用,按照《兽用化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》(以下简称《指导原则》)的要求,在建立兽药含量测定方法时,分析方法应充分考虑兽药生产工艺、制剂组分等因素,并对方法准确度、精密度、专属性、线性范围、耐用性等方面开展研究。本研究应用HPLC法同时测定复方磺胺嘧啶粉(水产用)中磺胺嘧啶和甲氧苄啶含量,经回收率试验测得其回收率均高于《指导原则》中对回收率限度的要求,且同一添加浓度与不同添加浓度试验的含量测定结果的RSD值均小于1.5%,说明试验结果与真实值偏差小、准确度高,测量方法的重复性好;同时,标准溶液经过24 h放置,溶液中两成分的含量无明显变化,其RSD值小于0.5%,为现实中大量样品的测定提供了试验数据。在耐用性试验中,本研究对流动相pH、柱温、流速、流动相比例和色谱柱在适当的范围内进行了调整,其对含量测定结果几乎无影响,RSD值均小于0.5%;专属性试验结果也表明该制剂中各个成分对测定结果互不干扰。说明本研究建立的方法满足《指导原则》中对兽药含量测定方法的技术参数要求。

同时,该制剂为磺胺嘧啶、甲氧苄啶与淀粉配制而成,其在该溶媒中为非澄清的溶液,为了保证目标物完全的溶解,本试验根据磺胺嘧啶和甲氧苄啶的溶解特性,选择了流动相和0.1 mol/L的氢氧化钠溶液作为对照品和样品的溶媒,通过磺胺嘧啶、甲氧苄啶两主峰峰面积的变化,分别考察了溶媒的用量和超声时间,发现当0.1 mol/L氢氧化钠溶液加入量不小于10 mL,超声时间不小于20 min时,两者完全溶解于溶媒中。

此外,为了确定检测波长,本研究运用二极管阵列检测器在200～400 nm的波长范围内对磺胺嘧啶和甲氧苄啶进行全波长的扫描。发现磺胺嘧啶在212 nm和266 nm的波长处有最大吸收,甲氧苄啶在222 nm和271 nm的波长处有最大吸收;虽然磺胺嘧啶和甲氧苄啶分别在200 nm附近和265～275 nm范围内均有最大吸收波长,但甲氧苄啶的在271 nm处的吸收值远远低于在220 nm附近的吸收值;同时为了规避短波长处流动相的吸收值对样品含量测定的影响,本试验选择240 nm处为本方法的检测波长,此波长选择与其他研究者相同[12]。

综上所述,本研究建立的同时测定复方磺胺嘧啶粉(水产用)制剂中磺胺嘧啶和甲氧苄的HPLC法快速、准确、环保,实现了对该制剂中2种成分含量测定,为提升该制剂的质量标准和控制水平奠定了基础。