Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序对菌阴肺结核的诊断价值分析

李红玲 余思婕 于媛媛

[摘要] 目的 探讨Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序对菌阴肺结核的诊断价值。方法 回顾性分析2019年12月至2022年5月诊断为菌阴肺结核的70例患者，分别进行Xpert MTB/RIF检测、宏基因组高通量测序及二者联合检测。采用固体培养法和比例法对生化病原菌进行诊断并分析诊断效能。采用预测值绘制受试者操作特征曲线。结果 Xpert MTB/RIF诊断阳性率75.57%，阴性率21.43%；宏基因组高通量测序诊断阳性率78.57%，阴性率21.43%；联合诊断阳性率88.57%，阴性率11.43%。Xpert MTB/RIF检测敏感度为77.55%、特异性为59.86%，曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.827；宏基因组高通量测序检测敏感度为77.47%、特异性为61.02%，AUC为0.808；联合检测敏感度为89.75%、特异性为89.57%，AUC为0.925。结果显示Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序在菌阴肺结核中诊断的敏感度、特异性均高于单一检测（P<0.05）。结论 Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序在菌阴肺结核诊断中具有较好的应用价值，值得临床推广使用。

[关键词] Xpert MTB/RIF；宏基因組高通量测序；菌阴肺结核；诊断价值

[中图分类号] R445      [文献标识码] A    [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.12.007

Diagnostic value analysis of Xpert MTB/RIF combined with high-throughput metagenomic sequencing

LI Hongling1， YU Sijie1， YU Yuanyuan2

1.Department of Infectious Diseases， Zhoushan Hospital， Zhoushan 316000， Zhejiang， China; 2.Department of Tuberculosis， Shanghai Pulmonary Hospital， Shanghai 200433， China

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value of Xpert MTB/RIF combined with metagenic high-throughput sequencing in bacterial negative tuberculosis. Methods Retrospective analysis of 70 patients diagnosed with bacterial negative pulmonary tuberculosis from December 2019 to May 2022 enrolled in the study. Xpert MTB/RIF testing， high-throughput metagenomic sequencing， and a combination of the two were performed， respectively. Solid culture and proportional methods were used to diagnose biochemical pathogens and analyze diagnostic efficacy. The receiver operating characteristic curve was drawn with the predicted value. Results The positive rate of Xpert MTB/RIF diagnosis was 75.57%， and the negative rate was 21.43%. The positive rate of high-throughput sequencing for metagenomics was 78.57%， while the negative rate was 21.43%; The positive rate of combined diagnosis was 88.57%， and the negative rate was 11.43%. The detection sensitivity of Xpert MTB/RIF was 77.55%， the specificity was 59.86%， and the area under the curve （AUC） was 0.827. The sensitivity of high-throughput sequencing for metagenomes was 77.47%， the specificity was 61.02%， and the AUC was 0.808. The sensitivity of the combined detection was 89.75%， the specificity was 89.57%， and the AUC was 0.925. The results showed that the diagnostic sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF combined with high-throughput metagenomic sequencing in bacterial negative pulmonary tuberculosis were higher than those of single detection （P<0.05）. Conclusion Xpert MTB/RIF combined with metagenic high-throughput sequencing has good application value in the diagnosis of bacterial negative pulmonary tuberculosis， and is worthy of clinical application.

[Key words] Xpert MTB/RIF; Metagenomic high-throughput sequencing; Bacterial negative pulmonary tuberculosis; Diagnostic value

结核病是世界范围内重点关注的传染性疾病，因其诊断较为复杂，防治工作较为严峻[1-2]。结核分枝杆菌可通过呼吸道或消化道侵入体内，而菌阴肺结核经痰涂片抗酸杆菌及痰培养分枝杆菌检查后结果呈阴性[3]。近年来，随着宏基因组二代测序技术（metagenomic next generation sequencing，mNGS）的发展提高了临床病原菌的检出率[4-5]。mNGS又称为高通量测序，可在不依赖预知病原体的前提下取得、鉴定多种病原微生物基因序列，可参与诊断、抗感染治疗。近年来开展的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术（Xpertmycobacteriumtuberculosis/rifampicin，XpertMTB/ RIF）检测技术是集结核病和利福平耐药rpoB基因突变检测为一体的检测方式，具有检测准确、迅速等优点。支气管镜检查可通过对支气管黏膜进行活组织检查来确诊肺结核；而肺泡灌洗液可通过将特殊液体注入肺小泡中并抽取液体样本来诊断。由此，本研究通过对患者进行支气管镜及肺泡灌洗液检查，进而对Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序在菌阴肺结核中的诊断价值进行分析，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

回顾性分析2019年12月至2022年5月舟山医院的电子病历系统中入院患者的病历资料，根据病史、临床特征及影像学等疑似诊断为肺结核的患者（有结核感染高危因素、结核感染中毒症状、胸部影像学改变，痰结核菌检测阴性）最终确认70例入组研究。所有患者均进行支气管镜及肺泡灌洗液检查，分别采用Xpert MTB/RIF、宏基因组高通量测序、Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序方法进行菌阴肺结核检测。本研究经舟山医院伦理委员会审批通过[伦理审批号：（2023）伦审第（128）号]。

1.2  诊断标准

参照《肺结核基层诊疗指南（2018年）》[6]及影像学特征检测结果，排除其他病症，且抗结核药物治疗经评估有效。纳入伴随病原学、病理诊断标准、采用现代分子生物学检测手段[荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、基因检测等]及联合临床相关资料等展开综合分析的确诊患者。

1.3  纳入及排除标准

纳入标准：①临床表现为慢性咳嗽、咳痰、盗汗、低热、乏力；②胸部X射线或CT显示斑片状阴影、结节状阴影、空洞等。

排除标准：①年龄未满18周岁；②以往有抗结核治疗史；③临床资料不完整；④诊断结果不明确；⑤伴随其他传染性疾病；⑥伴随其他恶性肿瘤或其他肺部炎症；⑦同期进行其他研究的患者；⑧有近1个月喹诺酮类药物用药史。

1.4  检测方法

1.4.1  Xpert MTB/RIF检测  采用奥林巴斯CV260电子支气管镜，以病变肺端作为灌洗位置，采用一次性灌洗液回收装置将37℃ 50ml无菌生理盐水经电子支气管镜注入叶段支气管负压吸引回收支气管肺泡灌洗液，并根据文献进行标本检测[7]。取1ml标本加入处理管中根据状态加2倍体积标本处理液，振荡30s，放置15min。取Xpert MTB/RIF试剂盒（购自美国Cepheid公司）检测。吸取2ml处理后样品放入检测盒在检测系统模块中全自动检测，待反应结束读取检测结果，其中Ct≤38为阳性[8]。

1.4.2  宏基因组高通量测序  根据患者胸部CT或X射线检查结果，以病变支气管为灌洗部位，将20ml 生理盐水经支气管镜灌入，负压吸引回收，重复3次，收集20ml送检。mNGS标准以分枝杆菌至少有一个被定位到种/属时为阳性结核分枝杆菌[9]。非结核分枝杆菌为当图读数排在细菌前10位时为阳性。常规实验室微生物检验：标本送常规病原学检测，细菌培养、真菌培养、抗酸染色、痰涂片等。

根据《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》标准分析[10]：①二代测序结果符合临床表现及实验室检查的根据二代测序结果进行临床决策；②二代测序结果显示阳性并符合临床表现，但缺少除二代测序结果外的其他数据支持用PCR进一步验证，常规实验室验证；③二代测序结果为阳性，但临床表现及实验室检测与该结果不一致则不能仅以二代测序结果判断，需以常规实验室检测结果为主要依据。MTB作为细胞内致病菌，丰度低且污染小，当至少1个读数被映射为种/属时为阳性[11]。

1.4.3  固体培养法分析  取灌洗液涂片行抗酸染色镜检。取灌洗液经4%氢氧化钠处理后无菌操作将标本置于培养基中接种，37℃分别培养3d、7d，记录生长状况，直到产生阳性结果，若42d后无生长迹象则可判定为阴性[12]。当培养基产生菌落时需采用生化实验菌种进一步鉴定，阳性标本培养依据《结核病实验室检验规程》[13]。

1.5  統计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理分析。计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，通过受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）分析不同检测方式在菌阴肺结核中的诊断效能，对Xpert MTB/RIF检测和金标准检测进行一致性检验（Kappa检验）。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  患者基本情况

纳入的70例患者中男42例、女28例；年龄<35岁28例、≥35岁42例；有吸烟史47例、无吸烟史为23例；咳嗽/咳痰42例；咳痰带血12例；发热26例；胸痛30例；X射线显示斑片、絮状29例；团块、结节状影37例；空洞影41例；胸腔积液28例，见表1。

2.2  Xpert MTB/RIF对结核分枝杆菌的检测效能分析

Xpert MTB/RIF在结核分枝杆菌中的阳性表达为75.57%，阴性表达为21.43%，见表2。

2.3  宏基因组高通量对结核分枝杆菌的检测效能分析

宏基因组高通量在结核分枝杆菌诊断中的阳性表达为78.57%，阴性表达为21.43%，见表3。

2.4  Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量对结核分枝杆菌的检测效能表达

Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量在结核分枝杆菌诊断中的阳性表达为88.57%，阴性表达为11.43%，见表4。

2.5  各检测方式在菌阴肺结核中的诊断效能分析

菌阴肺结核中Xpert MTB/RIF检测敏感度为77.55%、特异性为59.86%，AUC为0.827；宏基因组高通量检測敏感度为77.47%、特异性为61.02%，AUC为0.808；联合检测敏感度为89.75%、特异性为89.57%，AUC为0.925，见表5。

3  讨论

世界卫生组织表示结核病已成为全球十大死亡疾病之一，主要受肺部结核杆菌影响[14-15]。当前结核病实验室检测多以痰涂片为主，但该方式敏感度较低且不能对菌型及细菌耐药性进行鉴定，而结核杆菌检出是菌阴肺结核疾病防治的关键[16-17]。

Xpert MTB/RIF作为一种新型体外诊断方法，为全自动扩增核酸分子检测，可对样品进行预备、荧光扩增、定量PCR等检测。与传统检测相比，该技术不仅简单、便捷，且由于生物安全性高，在检测时不易受其他因素干扰。支气管镜肺泡灌洗术可提高菌阴肺结核涂片及分枝杆菌培养的阳性率。在此基础上应用Xpert MTB/RIF进一步检测可明显提高检测速率。研究发现，在利用痰液进行抗酸染色检测时，病原菌的阳性检出率较低，而通过收集肺泡灌洗液标本检测可明显强化抗酸杆菌涂片及培养的阳性率[18]。Xpert MTB/RIF在检测中不仅可对结核分枝杆菌、利福平耐药等初步筛查，且敏感度、特异性高，检测周期短。宏基因组高通量测序还可在平行筛查中进一步检验病原菌、病原体进化及流行病来源等[19]。本研究发现单一采用Xpert MTB/RIF及宏基因组高通量在结核分枝杆菌诊断中的阳性预测值较低，并存在非结核阳性情况。有学者表示，对于阳性拟诊断肺结核患者而言，Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量诊断的阳性预测值较高，且诊断价值明显优于单一检测[20]。

在病毒和细菌诊断方面，宏基因组高通量检测的阳性率高于传统检测3倍以上；且有研究发现，宏基因组高通量在病毒、真菌、厌氧菌等检测中的敏感度可达80%，并在免疫抑制宿主感染病原体诊断中也具有较高价值[21-22]。由于利福平结核分枝杆菌耐药基因大多集中于81bp核心突变区域，而GeneXpert MTB/RIF又恰好可检测rpoB基因片段核心区。因此，Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中优势明显，提示联合诊断不仅一致性良好且效果可靠，并可为临床治疗方案的选择提供一定依据。宏基因组高通量测序可更为准确、快速地对病原体进行鉴定，而以结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB作为靶基因可进一步判断菌群的分布情况。本研究预测值结果显示，菌阴肺结核中Xpert MTB/RIF检测敏感度为77.55%、特异性为59.86%，AUC为0.827；宏基因组高通量检测敏感度为77.47%、特异性为61.02%，AUC为0.808；联合检测敏感度为89.75%、特异性为89.57%，AUC为0.925。提示Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量在菌阴肺结核中的诊断敏感度、特异性均高于单一检测，诊断价值更高。

综上，采用GeneXpert MTB/ RIF与宏基因组高通量测序联合检测具有良好的临床价值，且在菌阴肺结核分子生物学筛查的检测中效用良好。但本研究由于样本量较小、对标本的收集不全面，且由于是回顾性研究，因此在诊断方法的选择上可能存在一定偏倚，后续应进一步完善。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2023–06–25）

（修回日期：2024–03–26）