大孔吸附树脂分离纯化甘草废渣中总黄酮的工艺研究

范博　舒泉湧　李宗霖　翟帆

摘要 ［目的］开发大孔吸附树脂分离纯化甘草废渣中总黄酮的工艺。［方法］以静态吸附试验比较D101B、AB-8、DM-130这3种大孔吸附树脂對甘草废渣中总黄酮的吸附量和解吸率，筛选最优树脂。采用单因素试验筛选动态吸附过程中样液浓度、上样速度、上样体积、20%乙醇洗脱体积、洗脱剂浓度、洗脱剂体积。［结果］AB-8大孔树脂用于分离纯化甘草废渣中总黄酮效果最佳，样液浓度为2.345～3.126 mg/mL，上样速度为1.0～1.5 mL/min，上样体积为64 mL，20%乙醇洗脱体积为5 BV，80%乙醇洗脱体积为4 BV。经过该纯化工艺总黄酮浓度从15.63%提升至65.68%。［结论］该方法适用于甘草废渣中总黄酮的初步分离纯化。

关键词 大孔吸附树脂；分离纯化；甘草废渣；总黄酮；工艺

中图分类号 R284.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2024）08-0159-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.08.037

Study on the Process of Separating and Purifying Total Flavonoids from Licorice Waste Residue Using Macroporous Resin

FAN Bo1，SHU Quan-yong2，LI Zong-lin3 et al

（1.Shaanxi Pharmaceutical Holding Group Co.， Ltd.， Xian，Shaanxi 710075;2.Shaanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712099;3. Shaanxi Pharmaceutical Holding Pharmaceutical Research Institute Co.， Ltd.， Xian，Shaanxi 710075）

Abstract ［Objective］To develop a process for separating and purifying total flavonoids from licorice waste residue using macroporous resin.［Method］Comparing the adsorption capacity and desorption rate of D101B， AB-8 and DM-130 for total flavonoids to screen the optimal resin.Single factor experiments were used to screen the sample concentration， sample flow rate， sample volume， 20% ethanol elution volume， eluent concentration and eluent volume during the dynamic adsorption process.［Result］AB-8 macroporous resin had the best separation and purification effect for total flavonoids in licorice waste residue. The sample concentration was 2.345-3.126 mg/mL， the sample flow rate was 1.0-1.5 mL/min， and the sample volume was 64 mL，20% ethanol elution volume was 5 BV， and 80% ethanol elution volume was 4 BV. After this purification process， the total flavonoid concentration increased from 15.63% to 65.68%.［Conclusion］This method is suitable for the preliminary separation and purification of total flavonoids from licorice waste residue.

Key words Macroporous adsorption resin;Separation and purification;Licorice residue;Total flavonoids;Process

甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根和根茎，在我国历代本草书籍中均有记载，具有补脾益气、清热解毒、祛咳止痰、缓急止痛、调和诸药的功效［1-2］。在我国，甘草是药食同源植物之一［3］，除了作为中药饮片应用外，主要用来提取甘草酸及制备甘草浸膏，通过煎煮法提取后的废渣多被丢弃，造成巨大的环境污染和资源浪费［4-8］。甘草废渣中含有甘草素、甘草查耳酮A及光甘草定等黄酮类物质，这些物质具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、美白等生理活性，被广泛应用于保健品和化妆品中，其中光甘草定更有“美白黄金”的称号［9-12］。目前关于甘草废渣中总黄酮的分离纯化研究较少。大孔吸附树脂可用于中药材中黄酮、生物碱、萜类、皂苷等常规的分离纯化，具有适用范围广、成本低、选择性强、易于再生等优点［13-16］。该研究采用大孔吸附树脂对甘草废渣中总黄酮进行分离纯化，以期为该药材的综合利用奠定基础。

1 试验材料

1.1 药材与试剂

甘草废渣，由陕西富捷药业有限公司提供；芦丁，UV测定时含量92.4%，中国食品藥品检定研究院；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、盐酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试验用水娃哈哈纯净水。D101B、AB-8、DM-130 大孔树脂，西安蓝晓科技新材料有限公司。

1.2 仪器

Cary 50 Conc 紫外-可见分光光度仪（Varian）；AG135&PB3002-S电子天平（METTLER TOLEDO）；1 000 μL & 100 μL移液枪（Eppendorf）；RE-2000A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KYC-100B台式恒温培养摇床（上海福玛实验设备有限公司）；101型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 甘草黄酮粗提物的制备

甘草废渣100 g，经50 ℃鼓风干燥，粉碎后过2号筛备用。加70%乙醇1 500 mL，加热回流提取1 h，过滤，滤渣加1 000 mL的70%乙醇再提取一次，合并滤液。减压蒸馏除去溶剂，50 ℃鼓风干燥，即得甘草黄酮粗提物。

2.2 甘草总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液制备。取芦丁对照品20 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加无水乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，备用。

2.2.2 标准曲线的绘制。

参考《中国药典》（2020版）一部槐花药材项下总黄酮含量测定方法［1］，精密量取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，各加水至3.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝试液1 mL，混匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，在500 nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线并进行线性回归，得线性方程为y=13.317x-0.001 29（R2=0.999 1），线性范围为0.008 12～0.048 72  mg/mL。

2.2.3 总黄酮含量测定方法。

取甘草黄酮粗提物约40 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加20%乙醇溶解。取1 mL置25 mL容量瓶中，按照“2.2.2”项下显色操作，记录吸光度，代入线性方程计算总黄酮含量。静态吸附及动态吸附试验得到的醇溶液取适量定容至线性范围，同法显色测定，计算总黄酮含量。

2.2.4 精密度试验。

取标准曲线溶液中第3份溶液（浓度0.022 mg/mL），在500 nm波长下测定吸光度6次，计算RSD为0.72%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验。

取标准曲线溶液中第3份溶液（浓度0.022 mg/mL），分别于0、5、10、15、20、25、30 min在500 nm波长下测定吸光度，计算RSD为1.32%，表明样品显色后在30 min之内稳定。

2.2.6 重复性试验。取甘草黄酮粗提物6份，每份约40 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加20%乙醇溶解。取1 mL 置25 mL容量瓶中，按照“2.2.2”项下显色操作，记录吸光度，代入线性方程计算总黄酮含量，6份样品含量RSD为2.06%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率。分别取甘草黄酮粗提物6份，每份约20 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，分别精密加入芦丁对照品溶液5 mL，摇匀溶解后，加20%乙醇溶液定容至刻度。取1 mL 置25 mL容量瓶中，按照“2.2.2”项下显色操作，记录吸光度，代入线性方程计算总黄酮含量，6份样品平均回收率为97.63%，RSD为2.32%，表明该方法准确度良好。

2.3 大孔吸附树脂预处理

取D101B、AB-8、DM-130 大孔树脂适量，投入烧杯中，加95%乙醇浸泡24 h，过滤，用95%乙醇反复清洗，直至乙醇液加水不浑浊。接着用纯化水冲洗，直到无明显的乙醇气味。然后用4%氢氧化钠溶液将树脂浸泡2～4 h，将碱液过滤，用纯化水冲洗至水接近中性。再用4%盐酸溶液将树脂浸泡2～4 h，将酸液过滤，用纯化水冲洗至水接近中性，抽干备用。

2.4 静态吸附研究

2.4.1 树脂筛选。

取甘草黄酮粗提物5 g，精密称定，共6份，分别置100 mL锥形瓶中，加入50 mL 20%乙醇超声溶解至无明显颗粒物。称取预处理的3种树脂各5 g，平行2份，置锥形瓶中，密塞。将锥形瓶置恒温摇床中振荡24 h（20 ℃，120 r/min），过滤，20%乙醇冲洗树脂并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，测定总黄酮含量，计算树脂吸附量：吸附量=（C0V0－C1V1）/M，式中，C0 、C1分别为初始浓度、吸附后滤液浓度，V0、V1分别为吸附前溶液体积、吸附后溶液体积，M为树脂质量。将树脂抽干，置100 mL锥形瓶中，加入50 mL乙醇，同上操作，进行静态解吸附试验，计算解吸率：解吸率=C2V2/（C0V0－C1V1）×100%，式中，C2 、V2分别为解吸附后总黄酮浓度和溶液体积。结果见表1，由表1可见AB-8树脂对甘草黄酮的吸附量和解吸率均较高，因此选择AB-8树脂对甘草黄酮粗提物进行分离纯化。

2.4.2 静态吸附曲线绘制。

取甘草黄酮粗提物5 g，共3份，分别置100 mL锥形瓶中，加入50 mL 20%乙醇超声溶解至无明显颗粒物。取AB-8树脂加入锥形瓶中，密塞，将锥形瓶置恒温振荡器中振荡（20 ℃，120 r/min），分别于1、2、3、4、5、6 h精密量取液体1 mL测定总黄酮浓度，计算吸附量。以时间为横坐标、吸附量为纵坐标绘制静态吸附曲线，结果如图1所示。由图1可知，5 h甘草总黄酮达到吸附平衡。

2.5 动态吸附研究

2.5.1 树脂动态吸附容量研究。

取预处理的AB-8树脂20 mL，精密称定，以20%乙醇为溶剂湿法装柱。取甘草黄酮粗提物8 g，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min 流量上样，每20 mL（1个柱体积，用1 BV表示）收集一份流出液，测定总黄酮含量。以流出液体积为横坐标、总黄酮浓度为纵坐标，绘制总黄酮动态吸附容量曲线，如图2所示。20 mL树脂可处理4 BV的料液而不发生泄露（以流出液浓度为上样浓度1/10为泄露标准），此时树脂床共吸附甘草总黄酮249.23 mg，即泄露前AB-8树脂对甘草总黄酮的动态吸附容量为12.46 mg/mL。达到饱和时可处理8倍树脂体积量，吸附容量可达17.09 mg/mL。当上样浓度为3.13 mg/mL，第4份流出液浓度为0.293 mg/mL，以此确定上样体积为80 mL，实际操作取80%作为上样体积，即64 mL。

2.5.2 上样浓度对动态吸附的影响。

取预处理的AB-8树脂20 mL，精密称定，共5份，以20%乙醇为溶剂湿法装柱。分别精密称取甘草黄酮粗提物2、4、6、8、10 g，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min 流量上样5 BV，用20%乙醇冲洗，合并水洗液及流出液，摇匀，测定总黄酮吸附质量。由图3可知，总黄酮吸附质量随着上样浓度增加而增加，当上样浓度为2.345 mg/mL后，动态吸附质量增加变缓。由于上样液浓度太低，树脂吸附饱和时间较长，而太高又会过早泄露或出现固体析出的问题，因此，最终确定上样浓度为2.345～3.126 mg/mL。

2.5.3 上样速度对动态吸附的影响。

取预处理的AB-8树脂20 mL，精密称定，共5份，以20%乙醇为溶剂湿法装柱。分别精密称取甘草黄酮粗提物6 g，共5份，加400 mL 20%乙醇溶解，分别以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min流量上样，测定总黄酮浓度，计算泄露前总黄酮吸附质量。结果见图4。流速过小，树脂吸附达到饱和所需时间较长，过大则提早泄露，树脂吸附容量小，由此确定上样流速为1.0～1.5 mL/min。

2.5.4 20%乙醇洗脱体积考察。

取预处理的AB-8树脂20 mL，精密称定，以20%乙醇为溶剂湿法装柱。取甘草黄酮粗提物6 g，精密称定，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min 流量上样64 mL。用20%乙醇以1 mL/min的流速进行洗脱，每一个柱体积（1 BV）收集一份洗脱液，测定总黄酮浓度，当浓度为上样浓度1/10时，即可终止20%乙醇洗脱。试验结果显示5 BV 20%乙醇洗脱较为合适。

2.5.5 洗脱剂浓度对解吸率的影响。

取预处理的AB-8树脂20 mL，精密称定，以20%乙醇为溶剂湿法装柱。称取甘草黄酮粗提物6 g，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min流量上样64 mL。用20%乙醇以1 mL/min的流速洗脫5 BV，然后分别以50%、60%、70%、80%、95%乙醇洗脱1 BV，分别收集洗脱液，测定总黄酮浓度，计算总黄酮解吸率及累积解吸率。从图5可以看出，80%乙醇能洗脱出绝大部分甘草总黄酮，因此选择80%乙醇作为解析溶剂。

2.5.6 动态解吸曲线绘制。

取预处理的AB-8树脂20 mL，精密称定，以20%乙醇为溶剂湿法装柱。称取甘草黄酮粗提物6 g，加400 mL 20%乙醇溶解，以1.0 mL/min 流量上样64 mL。用20%乙醇以1 mL/min的流速洗脱5 BV，然后以80%乙醇洗脱，每0.5 BV收集一份洗脱液，测定总黄酮浓度，以柱体积为横坐标、甘草总黄酮浓度为纵坐标绘制动态解吸曲线，如图6所示。由图6可知，4 BV的80%乙醇可将甘草总黄酮洗脱完全。

2.6 大孔吸附树脂分离纯化甘草总黄酮工艺验证试验

取预处理的AB-8树脂20 mL，精密称定，共3份，以20%乙醇为溶剂湿法装柱。称取甘草黄酮粗提物6 g，加400 mL 20%乙醇溶解，分别以1.0 mL/min 流量上样64 mL。用20%乙醇以1 mL/min的流速洗脱5 BV，然后以80%乙醇洗脱4 BV，收集洗脱液，减压干燥，得甘草总黄酮。结果如表2所示，AB-8树脂分离纯化甘草总黄酮的纯度为65.68%，收率为89.15%，表明该纯化工艺收率高，稳定性较好。

3 结论

该研究运用大孔吸附树脂分离纯化甘草废渣中的总黄酮，确定的最佳分离纯化工艺为：20 mL AB-8型大孔吸附树脂，甘草黄酮粗提物以20%乙醇溶解，上样体积为64 mL，浓度为2.345～3.126 mg/mL，上样速度为1.0～1.5 mL/min；洗脱时采用20%乙醇洗脱5 BV去除杂质，再用4 BV 80%乙醇洗脱甘草总黄酮，最终所得总黄酮纯度为65.68%。该工艺成本低廉、简单易行，适合工业化生产，为甘草资源的综合利用提供了一条新的途径。

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作者简介 范博（1988—），男，甘肃张掖人，工程师，从事中药及天然产物分离纯化研究。

收稿日期 2023-07-20