一株野生地生亚侧耳的分离鉴定及其生物学特性

韩振 何建清 葛彦宏 刘海鑫 徐东 张格杰

摘 要 从西藏农牧学院校园采集到一株野生亚侧耳（编号为HGHZ02），为了使该菌种得到更好的开发和利用，对其进行了鉴定和生物学特性研究。通过形态学和ITS序列聚类分析，鉴定菌株HGHZ02与勺状亚侧耳（Hohenbuehelia petaloides）的相似度达到100%，但通过形态学鉴定与地生亚侧耳形态特征最相似，因此将菌株HGHZ02鉴定为地生亚侧耳（Hohenbuehelia geogenia）。菌株HGHZ02菌丝最适生长碳源为麦芽糖，最适生长氮源为麦芽浸粉，最适温度为25  ℃，最适pH为pH 7.0，最适无机盐为磷酸氢二钾。正交试验结果表明，菌株HGHZ02最佳生长因子组合为麦芽糖 25.0 g/L、麦芽浸粉 3.0 g/L、pH 7.0 和温度 26  ℃。

关键词 地生亚侧耳；分离；鉴定；生物学特性

亚侧耳属（Hohenbuehelia）属于担子菌门（Basidiomycota），伞菌纲（Agaricomycetes），伞菌目（Agaricales），侧耳科（Pleurotaceae）［1］。该属分布于中国、苏联、日本、欧洲及北美等地区［2］，在中国多省有分布，主要单生或小群体生于针叶或阔叶树死木上，稀生于草地或灌丛中［3］。目前，全球共记录亚侧耳属有130多个，在中国报道的有12种，即亚侧耳（Hohenbuehelia serotina）、黑亚侧耳（H.nigra）、灰白亚侧耳（H.grisea）、橙囊亚侧耳（H.aurantiocystis）、勺形亚侧耳（H.petaloides）、巨囊亚侧耳（H.ingentimetuloidea）、渐狭亚侧耳（H.angustata）、肾形亚侧耳（H.reniformis）、橄榄绿色亚侧耳（H.olivacea）、暗蓝亚侧耳（H.atrocaerulea）、地生亚侧耳（H.geogenia）和小亚侧耳（H.fluxilis） ［4］。

研究表明，亚侧耳属具有抗肿瘤［5-6］、抗辐射［7］、抗疲劳［8］和衰老［9］等功效，具有丰富的营养成分。据报道，小亚侧耳（H.fluxilis）、勺状亚侧耳（H.petaloides）和肾形亚侧耳（H.reniformis）具有食用价值［10］。研究表明，亚侧耳属的无性型菌丝都具有捕食线虫的作用［11-15］，它们通过线虫被带有胶粘细胞的菌丝俘获，菌丝侵入体内，将虫体消化或者分生孢子遇到线虫膨胀就会产生粘性，随后粘住线虫表皮［14］。亚侧耳属真菌种类较多，但驯化栽培成功的较少，已驯化成功的有亚侧耳（H.serotina）、勺形亚侧耳（H.petaloides）和肾形亚侧耳（H.reniformis），亚侧耳（H.serotina）已实现商业化栽培。虽然亚侧耳属真菌具有较大的潜在经济价值，但由于亚侧耳属的野生资源量分布较少，产量低，采摘难，制约着对亚侧耳属的进一步研究。目前，关于地生亚侧耳的基础生物学研究还未见报道，为了更科学地对地生亚侧耳进行开发利用，同时也為地生亚侧耳的物种保护提供基础性资料，笔者从西藏农牧学院校园草坪上采集到1株地生亚侧耳子实体，采用组织分离法获得其菌丝体，通过形态特征和ITS序列聚类分析对其进行鉴定，单因素和正交试验探讨了不同营养因子对该菌株菌丝生长影响，以期为该菌种的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株子实体采自西藏农牧学院校园草坪（纬度 94°34′，经度 29°67′，海拔 3 100  m），现保存于西藏农牧学院大型真菌标   本馆。

1.1.2 供试培养基 母种分离培养基采用PDA 培养基［16］：马铃薯块200 g（去皮切片煮汁），葡萄糖 20 g，琼脂粉20 g，水1 000  mL，pH 6.5。

碳源、氮源测定培养基采用马铃薯综合培养基［16］：马铃薯块 200 g（去皮切片煮汁），蛋白胨  2 g，磷酸二氢钾 1 g、 磷酸氢二钾0.5 g、硫酸镁   0.5 g、琼脂粉20 g，水1 000 mL，pH自然。

无机盐基础培养基：马铃薯块 200 g（去皮切片煮汁），葡萄糖 20 g，酵母膏2 g，琼脂粉20 g， VB1 100 mg，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种分离 采用组织分离法［17-18］进行菌种分离，在超净工作台内将采集到的2株地生亚侧耳子实体用75%的酒精将表面进行消毒，将子实体撕开，用解剖刀取柄盖交界处黄豆粒大小的组织置于PDA平板上，25  ℃恒温培养箱中进行暗培养，菌丝多次进行转接，得到3组纯培养物，将其中一个编号为HGHZ02作试验菌株。

1.2.2 形态学鉴定

对采集到的新鲜标本用解剖刀纵切子实体观察其菇盖形状和颜色、菌肉颜色和质地，菌褶形状和着生情况，菌柄着生方式和质地、中实或中空等特征；采用徒手切片的方法，在光学和扫描电镜下观察其分生孢子和担孢子各80个，菌褶等形态特征，参照《中国大型菌物资源图鉴》［19］进行传统的形态学鉴定。

1.2.3 分子生物学鉴定 将分离纯化的菌株HGHZ02、HGHZ03、HGHZ04进行DNA的提取，利用 ITS1（ 5′-TCCGTAGGTGAACCTGC- GG-3′）和 ITS4（ 5′-TCCTCCGCTTATTGATA-TGC-3′）通用引物进行 PCR 扩增测序鉴定［20］，三者序列一致将测序结果获得的ITS序列在NCBI （National Center for Biotechnology Information）数据库中进行Blast比对分析。自测序列和 GenBank 下载的相关序列用MEGA-11 进行系统发育分析并构建进化树 ［21］。

1.2.4 菌丝体生物学特性研究 不同碳源对菌丝生长的影响：以无碳源马铃薯综合培养基  （“1.1.2”节）为空白对照，分别设置7种碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、淀粉）作为处理组，浓度均为20 g/L。用直径为8 mm打孔器从菌种培养基同一半径处打孔取菌块，菌面朝下接种在7种培养基上，25   ℃培养，当有一个处理菌丝长满时，停止试验，十字交叉法测量菌丝生长直径，每处理 5个重复。菌丝生长速度  （mm/d）=（最后一次测量菌落直径-第1次测量菌落直径）/培养时间。

不同氮源对菌丝生长的影响：以无氮源马铃薯综合培养基（“1.1.2”节）为空白对照，分别设置7种氮源（蛋白胨、酵母浸粉、尿素、 硝酸钠、硫酸铵、牛肉膏、酵母膏）作为处理组，浓度均为  20 g/L。其他操作同碳源影响试验。

温度试验：设置5个温度梯度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35  ℃），其他操作同碳源影响试验。

不同pH对菌丝生长的影响：设置5个pH梯度（6、7、8、9、10），其他操作同碳源影响试验。

不同无机盐对菌丝生长的影响：以无机盐基础培养基不添加无机盐为空白对照，设置分别加入硫酸镁（MgSO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4），作为不同无机盐处理，其他操作同碳源影响试验。

1.2.5 正交试验 选择最佳碳源、氮源、温度和pH进行L9（34） 4因子3水平正交试验（表1）。

1.2.6 数据处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行整理和方差分析。菌丝日均生长速率以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

2.1.1 子实体形态特征 野生担子果群生或近丛生于草地上，子实体中等大小，菌盖直径3～10 cm，初期勺状，后期花瓣状，初期淡肉桂色，后期淡肉桂色至浅黄褐色；边缘光滑、波浪状，中下部具白色至灰白色细小绒毛。菌肉白色，有蘑菇香味。菌褶白色，稠密、不等长，延生，窄。菌柄长  2～4 cm，直径0.7～2.0 cm，与菌盖同色，实心，具白色至灰白色细小绒毛（图1-A、1-B）。囊状体多（13.9～22.5）μm×（48.8～76.5）  μm，梭形，近纺锤形（图1-F）。担孢子（5.18～6.05） μm×  （3.36～4.05） μm，光滑、无色，椭圆形，非淀粉质（图1-G）。孢子印为白色。与其亲缘关系最近的勺状亚侧耳（H.petalodes）相比，菌株HGHZ02的子实体较大，菌盖和菌柄颜色更深，菌肉有蘑菇香味，孢子较小，生长环境为群生生于草坪上。

2.1.2 菌株营养菌丝的形态特征 在PDA平板中培养的菌落呈白色，絮状，气生菌丝多且致密（图1-C）。但菌丝生长缓慢，菌丝体5 d开始扩展，两个星期向周围延伸1 cm。分生孢子（3.5～5.8） μm×（5.4～12.1）  μm，椭圆形（图1-E）。在光學显微镜下，菌丝细胞壁较薄，有隔膜，无色透明，均一，分枝均匀，菌丝直径2.7～4.2 μm。锁状联合明显（图1-D）。

2.2 分子生物学鉴定

对菌株HGHZ02菌丝体经PCR扩增及测序分析表明，菌株HGHZ02 ITS序列长度为669 bp。GenBank登录号为OP692717。将其ITS序列进行Blast序列对比，采用MEGA-11构建系统发育进化树，菌株HGHZ02所有建树亚侧耳属的菌株相似性均高，其中与勺状亚侧耳（H.petalodes）相似度达到100%，并获得100%的支持率（图2）。但从形态学特征方面看，菌株HGHZ02与勺状亚侧耳（H.petalodes）存在明显的差异，与地生亚侧耳的形态学特征最相似［19］，因此，结合形态学和分子生物学特征，将菌株HGHZ02鉴定为侧耳科，亚侧耳属，地生亚侧耳（H.geogenia）。该种为西藏新纪录种。

2.3 菌丝体生物学特性

2.3.1 不同碳源对菌株HGHZ02菌丝生长速率的影响 由表2和图3可见，菌株HGHZ02在供试7种碳源中均能生长，菌丝生长速率最快的是麦芽糖和葡萄糖，菌丝生长速率分别为2.57 mm/d和2.30 mm/d，菌丝生长速率显著大于其他碳源（P＞0.05），且菌丝菌丝浓密均匀、长势旺盛，气生菌丝发达，其次是乳糖和果糖，菌丝生长速率分别为1.87 mm/d和1.83 mm/d，菌丝生长速率较差的是木糖、淀粉和蔗糖，菌丝生长速率分别为1.53 mm/d、1.60 mm/d 和1.57 mm/d。对菌丝生长速度、长势及数据的方差分析表明，菌株HGHZ02菌丝生长最适宜的碳源为麦芽糖。

2.3.2 不同氮源对菌株HGHZ02菌丝生长速率的影响 由表3和图4可见，菌株HGHZ02在供试7种氮源中均能生长，有机氮源较无机氮源对菌丝生长更有利，其中以麦芽浸粉为氮源时菌丝生长速率最快，菌丝生长速率达2.47 mm/d，其次为酵母膏和蛋白胨，菌丝生长速率分别达1.97 mm/d和1.83 mm/d，硫酸铵、硝酸钠和尿素作为氮源时，菌丝生长慢，长势弱，菌丝生长速率分别为1.67 mm/d、1.53 mm/d和0.53 mm/d。对菌丝生长速度、长势及数据的方差分析表明，菌株HGHZ02菌丝生长最适宜的氮源是麦芽浸粉。

2.3.3 不同温度对菌株HGHZ02菌丝生长速率的影响 由表4和图5可见，除在35  ℃条件下菌株HGHZ02菌丝不能生长，在其他温度条件下菌丝均可生长。其中以25  ℃时菌丝生长速率最快，菌丝生长速率达2.30 mm/d，其次为20  ℃和  15  ℃，菌丝生长速率分别达1.57 mm/d和1.50 mm/d，30  ℃时，菌丝生长慢，长势弱，菌丝生长速率为  1.20 mm/d。对菌丝生长速度、长势及数据的方差分析表明，25  ℃更适宜菌株HGHZ02菌丝的生长。

2.3.4 不同pH对菌株HGHZ02菌丝生长速率的影响 由表5和图6可见，菌株HGHZ02在5个不同的pH梯度下均能生长。其中以pH 10.0时菌丝生长速率最快，菌丝生长速率达3.77 mm/d，其次为pH 7.0和pH 9.0，菌丝生长速率分别达2.93 mm/d和2.77 mm/d，在pH 6.0和pH 8.0时，菌丝生长慢，长势弱，菌丝生长速率分别为2.47 mm/d和2.30 mm/d。综合考虑培养基内菌丝和气生菌丝生长情况，pH 7.0更适宜菌株HGHZ02菌丝的生长。

2.3.5 不同无机盐对菌株HGHZ02菌丝生长速率的影响 由表6和图7可见，菌株HGHZ02在供试3种无机盐中均能生长，其中以磷酸氢二钾（K2HPO4）为无机盐时菌丝生长速率最快，菌丝生长速率达3.50 mm/d，其次为磷酸二氢钾（KH2PO4）和硫酸镁（MgSO4）时，菌丝生长速率分别达3.47  和3.33 mm/d。对菌丝生长速度、长势及数据的方差分析表明，选取K2HPO4作为无机盐更有利于菌株HGHZ02菌丝的生长。

2.3.6 正交试验 根据以上6个单因子试验结果，挑选影响较大的碳源、氮源、pH和温度这4个因子3水平正交试验（表7，图8）。碳源、氮源、pH和温度这4个因子的极差R分别是0.38、  0.20、0.33和0.45， 4因素对菌株HGHZ02菌丝生长的影响依次表现为温度＞碳源＞pH＞氮源。其中，碳源均值依次为X2=X3>X1，氮源均值依次为X3>X1>X2，pH均值依次为X2>X3>X1，温度均值依次为X3>X2>X1，综合考虑得到最佳组合为A2B3C2D3，即麦芽糖25.0 g/L、麦芽浸粉3.0 g/L、pH 7.0和温度26  ℃，此时菌丝生长速度最快，效果显著。

3 结论与讨论

结合形态学和ITS序列分析，将菌株HGHZ02鉴定为地生亚侧耳（H.geogenia）。单因素试验结果表明：菌株HGHZ02菌丝生长最适碳源为麦芽糖，最适氮源为麦芽浸粉，最适温度为25  ℃，最适pH 7.0，最适无机盐为K2HPO4，最适生长因子为玉米粉。正交试验结果表明：菌株HGHZ02最佳因子组合为麦芽糖 25.0 g/L、麦芽浸粉 3.0 g/L、pH 7.0 和温度 26  ℃。

分子生物学鉴定结果表明，菌株HGHZ02与勺状亚侧耳（H.petalodes）相似度达到100%，并获得100%的支持率，但形态学鉴定结果表明，菌株HGHZ02与勺状亚侧耳（H.petalodes）在形态特征方面存在明显的差异，菌株HGHZ02与更符合地生亚侧耳（H.geogenia）的形态特征。生物学特性试验结果表明，地生亚侧耳菌株（HGHZ02）在不同供试碳源条件下生长适应性较好，并且以麦芽糖和葡萄糖条件下菌丝生长最好，差异不显著，这与竹文坤等［15］勺状亚侧耳菌株生物学特性研究结果一致。在氮源方面，以蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、酵母膏为氮源添加的培养基中地生亚侧耳菌丝生长较好，而以尿素、硝酸钠和硫酸铵为氮源时生长较差，说明地生亚侧耳菌株对有机氮源的利用率明显高于无机氮源，这可能是由于有机氮含有更多营养元素，如微量元素、维生素等，可以促进菌丝生长［22］。温度单因素筛选试验显示，地生亚侧耳固体培养最适温度为25  ℃，中低温条件更适合地生亚侧耳菌丝的生长。在该试验中，地生亚侧耳菌丝体表现出具有较广泛的酸碱环境适应性，pH的变化对于地生亚侧耳菌丝体的生长影响不大，这与前人的研究结果具有一致性［13］。在无机盐方面，地生亚侧耳在磷酸氢二钾为无机盐条件下菌丝体生长迅速，这可能是由于地生亚侧耳对于钾营养的要求偏高，或钾可以促进菌丝的生长。

虽然担子菌类产生无性孢子的种类和现象比较少，但少数伞菌也被证明可以通过无性孢子进行无性繁殖［23］。在本研究中，观察到地生亚侧耳双核菌丝产生的分生孢子，并且菌丝的培养时间与分生孢子的产生量呈正相关，这丰富了地生亚侧耳生活史的内容。

本研究对地生亚侧耳菌株HGHZ02进行了生物学特性的研究，其营养成分、驯化栽培、药理功效和生防药剂利用方面有待进一步研究，本试验对后续地生亚侧耳的开发研究和可持续利用提供了可能。

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Isolation，Identification and Biological Characteristics Analysis of a Wild Hohenbuehelia geogenia

HAN Zhen，HE Jianqing，GE Yanhong，LIU Haixin，XU Dong and ZHANG Gejie

（College of Plant Science，Tibet Agricultural and Animal Husbandry University，Linzhi   Xizang 860000，China）

Abstract A wild mushroom，identified as HGHZ02 was collected on the campus of Tibet Agricultural and Animal Husbandry in Linzhi，Tibet.In order to fully develop and utilize the strain，its biological characterization was identified.The results showed that  strain HGHZ02  exhibited 100% similarity to the Hohenbuehelia petaloides through morphology and ITS sequence clustering analysis.The morphological characteristics were found to be most similar to those of Hohenbuehelia geogenia.Therefore，strain HGHZ02 was identified as the Hohenbuehelia geogenia.The biological characteristics showed that maltose was the most suitable carbon source for mycelium growth ，malt extractpowder was the most suitable nitrogen sourc，the optimum temperature was 25  ℃，the optimum pH was 10.0，and the optimum inorganic salt was K2HPO4.Orthogonal experiments showed that the best combination of growth factors for strain HGHZ02 includes  maltose at 25.0 g/L，malt extract powder at 3.0 g/L，pH at 7.0，and a temperature of 26  ℃.

Key words Hohenbuehelia geogenia; Isolation; Morphology; Biological properties

Received  2022-11-09    Returned 2023-02-04

Foundation item Key Science and Technology Project of Tibet Autonomous Region （No.XZ202001ZY0019N）；Graduate Student Innovation Program of Tibet Agricultural and Animal Husbandry College （No.YJS2022-49，No.YJS2022-45）.

First author HAN Zhen，female，master student.Research area：wild rare food and medicinal mushrooms.E-mail：1713858673@qq.com

Corresponding   author HE  Jianqing，female，master supervisor.Research area：development and utilization of microbial resources.E-mail：hejianqingxz@163.com

（责任编辑：郭柏寿 Responsible editor：GUO Baishou）