甘谷伏椒挥发油成分及抗氧化活性研究

陶静 翁霞 王喜珠

摘要：甘谷伏椒是重要的调味品之一。文章采用水蒸气蒸馏法，利用正交试验设计，详细考察了甘谷伏椒挥发油的提取工艺条件。同时，采用气相色谱-质谱联用技术对所提取的挥发油的化学成分进行了鉴定和分析，并重点研究了挥发油对羟基自由基和DPPH自由基的清除能力。结果表明，水蒸气蒸馏法提取甘谷伏椒挥发油的最佳提取条件为料液比1∶10、浸泡时间4 h、蒸馏时间5 h。从挥发油中分析鉴定出41种化学成分，主要为γ-松油烯、E，E-金合欢醇乙酸酯、异松油烯、顺式-香叶醇等，其中不饱和烃类物质占挥发油成分的94.01%。抗氧化试验表明，挥发油具有较好的抗氧化能力，对羟基自由基和DPPH自由基均有较好的清除效果，最高清除率分别达到73.2%和93.9%。因此，甘谷伏椒挥发油具有较强的抗氧化功效，在调味品领域具有重要的应用价值。

关键词：甘谷伏椒；挥发油；水蒸气蒸馏法；化学成分；抗氧化活性

中图分类号：TS264.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）04-0079-06

Study on Components and Antioxidant Activity of Volatile Oil from Gangu Fujiao

TAO Jing1，2， WENG Xia1，2， WANG Xi-zhu1，2

（1.School of Chemistry and Life Sciences， Anshan Normal University， Anshan 114007， China;

2.Key Laboratory of Development and Utilization for Natural Product

Active Molecules in Liaoning Province， Anshan 114007， China）

Abstract： Gangu Fujiao is one of the important condiments. In this paper， the extraction process conditions of volatile oil from Gangu Fujiao are investigated in detail using steam distillation method and orthogonal test design. At the same time， the chemical components of the extracted volatile oil are determined and analyzed by GC-MS， and the scavenging capacity of the volatile oil on hydroxyl radicals and DPPH radicals is studied. The results show that the optimal conditions for the extraction of volatile oil from Gangu Fujiao by steam distillation method are as follows： solid-liquid ratio is 1∶10， soaking time is 4 h and distillation time is 5 h. There are 41 kinds of chemical components identified in the volatile oil and the main components are γ-terpinene， E，E-acacia alcohol acetate， terpinolene， cis-geraniol and so on. Among them， unsaturated hydrocarbons account for 94.01% of volatile oil components. The antioxidant test indicates that the volatile oil has good antioxidant capacity and good scavenging effects on hydroxyl radicals and DPPH radicals， with the highest scavenging rates of 73.2% and 93.9% respectively. Therefore， volatile oil from Gangu Fujiao has strong antioxidant function and important application value in the field of condiments.

Key words： Gangu Fujiao; volatile oil; steam distillation method; chemical components; antioxidant activity

收稿日期：2023-10-30

基金項目：辽宁省百千万人才工程项目（2019921009）；辽宁省自然科学基金面上项目（201602001）；鞍山师范学院校企合作项目（PAN2018011）

作者简介：陶静（1975—），女，湖南长沙人，教授，硕士，研究方向：天然产物提取及功能。

甘谷伏椒属于芸香科花椒属植物[1]，是我国重要的调味品之一。其色泽鲜艳、味道醇厚、香气浓郁，含有丰富的有益人体健康的成分，出油率高[2]，广泛应用于食品和保健品等领域[3]。近年来，对同属植物的研究主要集中在优化提取工艺、化学成分分析、抗菌活性、生物活性等方面[4]。樊丹青等[5]通过对不同产地花椒的挥发油含量及组成成分进行研究，得出含量最高的化合物为芳樟醇。祝晓云等[6]研究发现，青、红花椒挥发油中的主要成分为芳樟醇和4-萜烯醇等。另外，部分学者研究发现，同属植物挥发油具有清除自由基、保护细胞免受氧化损伤的功效[7]。景娜娜[8]采用DPPH自由基清除试验证明鲜花椒挥发油具有较强的抗氧化能力。陈艳等[9]研究发现花椒挥发油对DPPH自由基有一定的清除能力，但低于VC的清除能力。因此，作为一种天然调味品，花椒属植物的挥发油在食品领域具有广阔的应用前景，尤其在开发新型天然抗氧化剂方面具有重要的应用价值[10]。

本试验采取水蒸气蒸馏法提取甘谷伏椒揮发油[11]。根据单因素试验及正交试验，由方差分析结果得出最佳提取条件并计算出对应的提取率[12]。采用气相色谱-质谱（GC-MS）并结合NIST 20.L谱图库对甘谷伏椒挥发油中的化学成分进行分析[13-14]。根据所查文献中的相关内容进行改进试验，研究了伏椒挥发油对羟基自由基和DPPH自由基的清除能力，并利用单因素试验和方差分析得出挥发油浓度与清除率之间的关系，最后对这两种方法的结果进行了对比分析[15-16]。

1 材料与仪器

1.1 材料

伏椒：购于甘肃省天水市甘谷县。

1.2 试剂

人造沸石（20～40目，化学纯）、七水合硫酸亚铁（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸钠（分析纯）、双氧水（质量分数30%）：天津市光复科技发展有限公司；无水乙醇（分析纯）：辽宁泉瑞试剂有限公司；水杨酸（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；DPPH（质量分数96%）：上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.3 仪器

98-Ⅰ-B型电子调温电热套 天津市泰斯特仪器有限公司；TYSP-500A型高速多功能摇摆粉碎机 浙江省永康市红太阳机电有限公司；BCD-215KS冰箱 青岛海尔股份有限公司；BS124S型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；D-100普兰德单通道移液器 上海吉泰生物科技有限公司；DZKW-S-6型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；721G可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；Agilent 7000D三重四极杆气质联用仪 美国安捷伦公司。

2 试验方法

2.1 不同提取方法的比较

2.1.1 水蒸气蒸馏法提取伏椒挥发油

参考文献[17]的方法，采用水蒸气蒸馏法提取伏椒挥发油。准确称取20.00 g伏椒粉末，置于圆底烧瓶内，加入100 mL去离子水浸泡过夜。次日，再加入相同体积的水和少许沸石，加热提取5 h，收集上层油层，加入无水硫酸钠除去水分，称重，于－4 ℃冰箱中保存备用。

2.1.2 索氏提取法提取伏椒挥发油

参考文献[18]的方法，采用索氏提取法提取伏椒挥发油。称取25.00 g伏椒粉末，先置于滤纸筒内，后置于索氏提取器中。取125 mL石油醚为提取溶剂，在（80±5） ℃的恒温水浴条件下进行索氏提取。提取结束后，将旋转蒸发除去有机试剂后得到的伏椒挥发油装入棕色瓶中，于－4 ℃冰箱中保存备用。

2.2 水蒸气蒸馏法提取伏椒挥发油的工艺研究

本试验以粉碎时间、蒸馏时间、浸泡时间、料液比作为考察因素，以伏椒挥发油提取率为指标进行一系列单因素试验。

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 粉碎时间对伏椒挥发油提取率的影响

称取4份20.00 g伏椒，浸泡时间为4 h，料液比为1∶9，蒸馏时间为5 h，粉碎时间分别为0，1，2，3 min，依次提取并计算提取率。

2.2.1.2 蒸馏时间对伏椒挥发油提取率的影响

称取4份20.00 g粉碎程度相同的伏椒粉末，浸泡时间为4 h，料液比为1∶9，蒸馏时间分别为3，4，5，6 h，依次提取并计算提取率。

2.2.1.3 浸泡时间对伏椒挥发油提取率的影响

称取4份20.00 g粉碎程度相同的伏椒粉末，蒸馏时间为5 h，料液比为1∶9，浸泡时间分别为0，4，8，12 h，依次提取并计算提取率。

2.2.1.4 料液比对伏椒挥发油提取率的影响

称取3份20.00 g粉碎程度相同的伏椒粉末，蒸馏时间为5 h，浸泡时间为4 h，料液比分别为1∶9、1∶10、1∶11，依次提取并计算提取率。

2.2.2 正交试验

根据单因素试验结果，发现粉碎时间对伏椒挥发油提取率的影响较小。因此，选择料液比（A）、浸泡时间（B）和蒸馏时间（C）作为影响因素，每个因素取3个水平。设计L9（33） 正交表，进行正交试验。

2.3 气相色谱-质谱联用分析条件

气相色谱条件：升温程序：初始温度50 ℃，以120 ℃/min升至230 ℃，恒温3 min；进样量1 μL，溶剂延迟3 min。进样口温度为250 ℃；载气为氦气，载气流速为8 mL/min；分流比为50∶1。

质谱条件：离子源为电子轰击离子源；离子源温度230 ℃；电离电压60 eV；电子倍增器电压1 341 V；发射电流35.0 μA；接口温度230 ℃；质量扫描范围（m/z）：10～1 050 amu。

2.4 伏椒挥发油抗氧化性的研究

2.4.1 羟基自由基清除能力的测定

参考文献[19]的方法，分别吸取1，2，3，4，5，6 μL伏椒挥发油于试管中，用2 mL无水乙醇进行稀释，混匀后得到不同浓度的样品溶液，重复2次。

在两组试管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液和9 mmol/L的乙醇-水杨酸溶液各1 mL。其中，在试验组中加入1 mL H2O2溶液（8.8 mmol/L），在对照组中加入去离子水1 mL。混合均匀后，在37 ℃的恒温水浴锅中加热30 min，然后测定试验组和对照组在510 nm处的吸光度（λabs=510 nm），分别记为A1、A2。用2 mL去离子水代替样品溶液，同试验组操作一致，即空白对照组记为A0。测定多次，取平均值。由公式（1）计算伏椒挥发油对羟基自由基的清除率。

清除率（%）=A0+A2－A1A0×100%。（1）

式中：A0为空白对照的吸光度；A1为加样品的吸光度；A2为未加显色剂H2O2的吸光度。

2.4.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照文献[20]的方法，分别取60，70，80，90，100，110 μL伏椒挥发油于试管中，与2 mL无水乙醇混合，得到不同浓度梯度的挥发油溶液，平行做两组试验：一组中加入2 mL DPPH溶液，另一组中加入2 mL无水乙醇，充分混合后于避光处静置30 min，测定520 nm处的吸光度，分别记为A1和A2。A0表示不加样品溶液时DPPH溶液的吸光度，做多组平行试验。将测得的吸光度值带入DPPH自由基的清除率计算公式（同公式（1）），得到不同浓度的样品溶液对DPPH自由基的清除率。

3 结果与讨论

3.1 不同提取方法的比较

比较了分别采用水蒸气蒸馏法和索氏提取法时伏椒挥发油的提取率和质量。从提取率来看，水蒸气蒸馏法为4.32%～11.91%，产率较低；索氏提取法为11.86%～13.06%。但是，从提取出的挥发油品质来看，索氏提取法得到的挥发油呈黄色，气味比较浓烈，颜色较浑浊，品质较差，而水蒸气蒸馏法提取得到的挥发油气味浓烈，颜色澄清透明，杂质少，品质相对较好。综上，水蒸气蒸馏法能最大程度地减少杂质，工艺较简单，故后续试验采用水蒸气蒸馏法提取伏椒挥发油。

3.2 水蒸气蒸馏法提取伏椒挥发油的最佳工艺分析

3.2.1 单因素试验结果及分析

3.2.1.1 粉碎时间对伏椒挥发油提取率的影响

粉碎时间对伏椒挥发油提取率的影响见图1。

由图1可知，虽然伏椒的粉碎时间越长，颗粒越细，同条件下的提取率也越高，但总体上看，粉碎时间对伏椒挥发油提取率的影响不显著，因此在本试验中不作为主要因素进行下一步考察，选取粉碎时间为2 min开展后续试验。

3.2.1.2 蒸馏时间对伏椒挥发油提取率的影响

蒸馏时间对伏椒挥发油提取率的影响见图2。

由图2可知，伏椒挥发油的提取率在蒸馏时间为5 h时达到最高，为11.91%，所以选取4，5，6 h为伏椒挥发油正交试验蒸馏时间的3个水平。

3.2.1.3 浸泡时间对伏椒挥发油提取率的影响

浸泡时间对伏椒挥发油提取率的影响见图3。

由图3可知，随着浸泡时间的增加，伏椒揮发油的提取率先上升后下降。当浸泡时间为4 h时，提取率达到最大值11.91%，所以选取4，8，12 h为伏椒挥发油正交试验浸泡时间的3个水平。

3.2.1.4 料液比对伏椒挥发油提取率的影响

料液比对伏椒挥发油提取率的影响见图4。

由图4可知，当料液比为1∶10时，提取率达到最大值11.91%，所以选取1∶9、1∶10、1∶11作为伏椒挥发油正交试验料液比的3个水平。

3.2.2 正交试验及分析

根据单因素试验结果，发现粉碎时间对伏椒挥发油提取率的影响较小。因此，选择料液比（A）、浸泡时间（B）和蒸馏时间（C）作为影响因素，同时以空白为对照组，每个因素取3个水平。设计L9（33） 正交试验，因素水平表见表1，正交试验结果见表2，甘谷伏椒挥发油的正交试验方差分析结果见表3。

由表3可知，因素A对提取率的影响极显著，因素C对提取率的影响显著，因素B对提取率的影响不显著。因素影响主次顺序为A＞C＞B，最佳水平为A2B1C2，该条件下伏椒挥发油的提取率可达到11.91%。

3.3 伏椒挥发油成分及含量

通过GC-MS分析鉴定最优提取条件下获得的甘谷伏椒挥发油样品，得到伏椒挥发油的总离子流图（见图5），通过G170LBA化学工作站检索NIST 20.L谱图库，得到伏椒挥发油的化学成分组成，见表4。

由表4可知，伏椒挥发油的主要成分为γ-松油烯、E，E-金合欢醇乙酸酯、异松油烯和顺式-香叶醇等，其中不饱和烃类物质占总挥发油成分的94.01%。

3.4 挥发油抗氧化性成分研究分析

3.4.1 羟基自由基清除能力的测定

不同浓度的伏椒挥发油对羟基自由基的清除率见图6。

由图6可知，伏椒挥发油溶液对羟基自由基具有一定的清除效果，在试验浓度范围内，清除羟基自由基的能力随着样品溶液浓度的增大而逐渐升高，羟基自由基清除率最高可达到73.2%。

根据图6中的数据进行方差分析，结果见表5。

根据表5以及查F值分布表得出：F0.05（5，12）=3.11，F0.01（5，12）=5.06，表明伏椒挥发油的浓度对羟基自由基的清除率有极显著影响。

3.4.2 DPPH自由基清除能力的测定

不同浓度的伏椒挥发油对DPPH自由基的清除率见图7。

由图7可知，伏椒挥发油溶液对DPPH自由基具有一定的清除效果，在试验浓度范围内，清除DPPH自由基的能力随着样品溶液浓度的增大而逐渐升高，DPPH自由基清除率最高可达到93.9%。

根据图7中的数据进行方差分析，结果见表6。

根据表6以及查F值分布表得出：F0.05（5，12）=3.11，F0.01（5，12）=5.06，表明伏椒挥发油的浓度对DPPH自由基清除率有极显著影响。

4 结论

通过提取甘谷伏椒挥发油并对其化学成分进行鉴定分析，得出甘谷伏椒挥发油的最佳提取工艺条件和主要成分及含量。利用水蒸气蒸馏法提取甘谷伏椒中的挥发油，得到的伏椒挥发油颜色透明，无杂质，具有丰富的伏椒香气。通过单因素试验设计出对应的正交试验，并对验证结果进行方差分析，得出水蒸气蒸馏法的最佳提取工艺条件为料液比1∶10、浸泡时间4 h、蒸馏时间5 h，最优条件下的提取率为11.91%。通过查找文献资料和检索NIST 20.L谱图库，从甘谷伏椒挥发油中鉴定出41种化学成分，主要成分为γ-松油烯、E，E-金合欢醇乙酸酯、异松油烯和顺式-香叶醇等。其中，γ-松油烯的含量最高，为15.34%，不饱和烃类物质占挥发油总成分的94.01%。另外，通过对伏椒挥发油抗氧化性的研究，发现其具有较强的抗氧化性，对羟基自由基和DPPH自由基均有较好的清除效果，其清除能力随着浓度的增大而增大，最高分别达到73.2%和93.9%。上述研究为甘谷伏椒的开发利用和挥发油的抗氧化研究提供了借鉴和依据。

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