小叶黄杨叶中化学成分对非小细胞肺癌A549增殖抑制作用的研究

明 洋，赵 莎，郑一敏，胥秀英

(重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400050)

小叶黄杨(Buxussinicavar.parvifolia)是黄杨科黄杨属黄杨的一种,[1-2]含有生物碱类、黄酮类、甾醇、香豆素、木脂素和酸类化合物,[3-4]其叶有清热解毒、化痰止咳、祛风、止血的功能。[5-6]有报道黄杨植物的生物碱成分具有抗肿瘤、抗菌、抗HIV、抗乙酰胆碱酯酶等作用。[7-9]

柏石头等[10]对小叶黄杨全株化学成分进行研究，但对小叶黄杨叶抑制肺癌活性成分报道较少，本文针对小叶黄杨叶中化学成分对非小细胞肺癌A549增殖抑制研究，报道如下。

1 材料与仪器

1.1 药材

供试药材产自江苏，由重庆理工大学傅善权副主任技师鉴定为黄杨科黄杨属植物小叶黄杨(Buxus Microphylla)叶，批号：230324。非小细胞肺癌细胞(A549)由实验室传代培养得到。

1.2 仪器与试剂

DZF-6050真空干燥箱(天津泰斯特有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(河南省予华仪器公司)，RE-52AA旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司)，核磁(NMR)-600MHz(瑞士Bruker)，核磁(AVANCE NEO)-400MHz(瑞士Bruker)，Finnigan-LCQDECA(ESI-MS)(美国热电公司)、倒置显微镜(日本Olympus)、超低温冰箱(河南鑫贝西生物技术有限公司)、酶标仪(美国赛默飞)、洁净工作台(苏净安泰空气技术有限公司)、恒温CO2细胞培养箱(美国赛默飞)。95 %乙醇、盐酸、石油醚(重庆川东化工(集团)有限公司)，三氯甲烷、二氯甲烷(成都市科隆化学品有限公司)分析纯、胎牛血清(AusGenex)、CCK-8试剂盒(北京兰杰柯科技有限公司)、胰蛋白酶EDTA(上海源培)、青链霉素混合液(上海源培)、二甲基亚砜(生物级)(上海麦克林化学试剂有限公司)、DMED培养基(BasalMedia)、吉非替尼(Aladdin：G408705-1ml)。

2 提取与分离

小叶黄杨10.0 kg叶干燥，粉碎后加10倍量(V/W)的75 %乙醇浸泡过夜，60℃水浴回流提取3次，2 h/次。[9]合并滤液，过滤，减压浓缩，60℃干燥过夜，即得小叶黄杨叶浸膏。浸膏分别用石油醚、氯仿萃取3次，合并萃取液，得石油醚萃取液与氯仿萃取液；减压浓缩至膏状，分别得到石油醚部分与氯仿部分。

石油醚部分经硅胶色谱柱(300-400目)分离，洗脱剂依次为二氯甲烷-甲醇(50∶1-5∶1)进行梯度洗脱，得化合物1和4个部分(A1-A4)，A1部分以石油醚-甲醇(1∶1)洗脱得到化合物2，A3部分以氯仿-甲醇-氨水(8∶1∶0.1)混合溶剂为洗脱剂进行等度洗脱，得D1、D2两部分，浓缩干燥，加入适量甲醇溶液进行重结晶，放置冰箱，等待析出样品，得白色粉末状化合物3、化合物4。

氯仿部分经硅胶色谱柱(10～25 μm)分离，二氯甲烷和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱(二氯甲烷-甲醇30∶1～4∶1)，得化合物5和4个部分(D1-D4)；D1以氯仿-甲醇-氨水(8∶1∶0.1)→(10∶1∶0.1)梯度洗脱得化合物6(4 mg)。D3以二氯甲烷-甲醇(10∶1)等度洗脱，得化合物8(3 mg)。D4以氯仿-甲醇-氨水(8∶1∶0.1)等度洗脱得3个组分，D4-1以氯仿-甲醇(9∶1)洗脱得化合物7(3 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末状固体，分子式C30H50O2，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 4.69(d，J=2.4 Hz，1H)，4.59(s，1H)，3.81(d，J=10.8 Hz，1H)，3.34(d，J=10.8 Hz，1H)，3.20(dd，J=11.2，4.9 Hz，1H)，2.40(td，J=10.9，5.8 Hz，1H)，2.03-1.90(m，2H)，1.87(dd，J=12.1，8.5 Hz，1H)，1.69(s，5H)，1.67 - 1.65(m，2H)，1.62(q，J=4.7，4.0 Hz，2H)，1.59(s，1H)，1.54(d，J=10.3 Hz，2H)，1.44(d，J=3.8 Hz，1H)，1.41(s，3H，CH3)，1.33 - 1.25(m，3H，CH3)，1.21(dd，J=12.9，4.2 Hz，2H)，1.11- 1.05(m，2H)，1.03(s，4H)，0.99(d，J=4.7 Hz，6H，2×CH3)，0.90(dt，J=12.5，6.1 Hz，1H)，0.83(s，3H，CH3)，0.77(s，3H，CH3)，0.70(d，J=9.6 Hz，1H)；13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ150.50，109.71，78.98，60.53，55.27，50.38，48.74，47.79，42.71，40.90，38.87，38.69，37.29(C-8)，37.15，34.22，33.97，29.73，29.16，27.99，27.38，27.03，25.19，20.82，19.08，18.30，16.12，15.98，15.38，14.76。经上述波谱分析及文献[11]报告化合物1为白桦脂醇。

化合物2：白色粉末状固体，分子式C30H50O，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 4.70(d，J=2.5 Hz，1H)，4.58(dd，J=2.6，1.4 Hz，1H)，3.20(dd，J=11.2，5.0 Hz，1H)，2.40(td，J=11.1，5.8 Hz，1H)，1.93(ddt，J=13.6，10.5，5.0 Hz，1H)，1.70(s，5H)，1.68-1.58(m，3H，CH3)，1.57-1.46(m，3H，CH3)，1.45-1.29(m，10H)，1.28-1.15(m，3H，CH3)，1.14-0.97(m，8H)，0.96(s，3H，CH3)，0.82(d，J=16.2 Hz，6H，2×CH3)，0.78(s，3H，CH3)，0.69(d，J=2.7 Hz，1H)；13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ 151.00，109.35，79.01，55.29，50.43，48.29，48.00，43.01，42.83，40.83，40.01，38.87，38.70，38.04，37.17，35.59，34.27，29.84，28.00，27.45，27.42，25.13，20.93，19.32，18.32，18.01，16.14，15.98，15.39，14.56。经上述波谱分析及文献[12]报告化合物2为羽扇豆醇。

化合物3：白色粉末固体，ES-MS：[M+H]+=419.48，分子式C26H46N2O2，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ 4.07(ddd，J=10.2，7.3，2.9 Hz，1H)，3.72(d，J=10.3 Hz，1H)，3.54(d，J=10.3 Hz，1H)，2.76(dd，J=10.9，4.0 Hz，1H)，2.65(dq，J=10.7，6.6 Hz，1H)，2.23(d，J=34.1 Hz，7H)，2.06(ddd，J=14.8，11.1，6.0 Hz，1H)，1.96 -1.81(m，2H)，1.70 - 1.54(m，3H，CH3)，1.54 - 1.43(m，3H，CH3)，1.39(ddd，J=12.3，6.7，3.7 Hz，2H)，1.34 - 1.26(m，1H)，1.25 - 1.18(m，1H)，1.14(s，3H，CH3)，1.13 - 1.04(m，2H)，0.99(d，J=2.1 Hz，6H，2×CH3)，0.89(d，J=6.6 Hz，3H，CH3)，0.86-0.76(m，1H)，0.61(d，J=4.2 Hz，1H)，0.36(d，J=4.3 Hz，1H)；13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ 79.02，73.95，62.42，59.48 ，57.01，47.93，47.25，45.12，44.75，44.63，42.01，39.96，34.70，32.68，31.56，30.44，26.20，25.84，25.67，21.08，20.82，19.45，19.01，9.63，9.61。经上述波谱分析及文献[13]报告，化合物3为羟基环原黄杨碱。

化合物4：白色粉末固体，ES-MS：[M+H]+=565.72，分子式C35H52N2O4，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ 7.74-7.70(m，2H，Ph)，7.56-7.47(m，1H，Ph)，7.49-7.41(m，2H，Ph)，5.86(d，J=9.8 Hz，1H)，4.40(ddd，J=12.2，9.8，4.4 Hz，1H)，4.08(ddd，J=10.3，7.4，3.0 Hz，1H)，3.86(q，J=11.5 Hz，2H)，2.66(dt，J=10.7，6.4 Hz，1H)，2.24(d，J=34.9 Hz，8H)，2.13(s，3H，CH3)，1.96(dd，J=12.4，4.4 Hz，1H)，1.93 -1.85(m，3H，CH3)，1.83 - 1.69(m，2H)，1.69(s，1H)，1.59 - 1.48(m，2H)，1.45 - 1.25(m，3H，CH3)，1.19(s，3H，CH3)，1.18-1.07(m，2H)，1.01(s，3H，CH3)，0.96-0.88(m，6H，2×CH3)，0.86-0.76(m，1H)，0.70(s，1H)，0.59(d，J=4.4 Hz，1H)，0.40(dd，J=13.6，4.1 Hz，1H)；13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ 171.36，167.08，135.23，131.31，128.58，126.80，79.06，79.02，65.77，62.43，57.01，51.00，48.06，47.30，44.81，44.65，42.52，42.02，32.27，31.52，30.30，28.45，26.17，25.85，25.67，21.17，21.15，21.02，19.68，19.04，11.62，9.63。经上述波谱分析文献[13]报告，化合物4为羟基环原黄杨碱酯。

化合物5：白色固体粉末，ES-MS：[M+H]+=403，分子式C26H46ON2，1H NMR(400 MHz，Chloroform-d)δ 4.09(dt，J=15.1，7.5 Hz，1H)，3.61(dd，J=70.5，10.3 Hz，1H)，2.78(d，J=9.3 Hz，2H)，2.66(dd，J=10.9，6.5 Hz，2H)，2.63-2.44(m，3H)，2.25(s，4H)，2.10-1.95(m，2H)，1.90-1.79(m，3H)，1.69-1.41(m，8H)，1.38(d，J=11.9 Hz，3H)，1.33(s，1H)，1.27(d，J=12.0 Hz，2H)，1.11(d，J=8.0 Hz，3H)，0.97(d，J=9.5 Hz，6H)，0.89(d，J=6.5 Hz，3H)，0.59(d，J=3.9 Hz，1H)，0.34(d，J=3.9 Hz，1H)，13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ 78.84，73.58，62.51，59.37，56.93，47.92，47.25，45.06，44.78，44.67，41.94，34.30，32.61，31.55，30.44，30.19，26.18，25.83，25.61，21.07，20.81，19.05，9.69。13C NMR碳谱数据显示该化合物有26个碳，根据DEPT图显示该化合物含有7个CH3，9个CH2，6个CH，4个季碳。经上述波谱分析化合物5为N-甲基黄杨宁。化合物5的结构图如图1所示。

图1 化合物5的结构图

化合物6：白色粉末固体，ES-MS：[M+H]+=249，分子式C15H24ON2，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 3.44-3.39(m，1H)，3.38(d，J=6.2 Hz，1H)，3.34(d，J=6.1 Hz，1H)，2.92-2.78(m，2H)，2.32(d，J=1.4 Hz，1H)，2.31(d，J=2.3 Hz，1H)，2.29-2.22(m，2H)，2.18-2.04(m，2H)，2.06-1.90(m，2H)，1.90-1.46(m，10H)，1.10(tdd，J=12.9，11.3，4.2 Hz，1H)。13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ 170.00，63.27，55.86，55.68，50.26，47.54，40.91，32.49，30.76，30.16，28.08，23.63，21.71，21.50，18.88。经上述波谱分析及文献[13]报告化合物6为苦参素。

化合物7：白色固体粉末，ES-MS：[M+H]+=495，分子式C31H46O3N2，1H NMR(400 MHz，Chloroform-d)δ7.89-7.70(m，1H)，7.52(dt，J=30.6，7.2 Hz，2H)，7.28(s，2H)，4.37-4.12(m，1H)，3.11(d，J=12.6 Hz，1H)，2.57-1.96(m，6H)，1.94(d，J=10.9 Hz，2H)，1.88(dd，J=15.4，5.4 Hz，2H)，1.82(s，1H)，1.77(d，J=9.4 Hz，2H)，1.76-1.65(m，2H)，1.58-1.46(m，3H)，1.48-1.40(m，3H)，1.39-1.29(m，2H)，1.29(d，J=11.9 Hz，2H)，1.17(s，2H)，0.97(dd，J=20.2，13.7 Hz，7H)，0.81-0.68(m，3H)，0.58(d，J=3.9 Hz，1H)，0.39(d，J=4.1 Hz，1H)。13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ 168.61，134.04，131.87，128.77，126.91，78.54，64.25，56.95，51.74，48.04，47.36，45.08，44.71，40.49，32.67，31.70，30.57，27.91，26.15，25.80，25.68，25.66，20.91，20.80，19.50，19.11，11.51，9.94。13C NMR 碳谱数据显示该化合物有31个碳，根据DEPT图显示该化合物含有 5个CH3，9个CH2，10个CH，7个季碳，其中δ 134.04，δ 131.87，δ128.77，δ 126.91为苯环上的碳。经上述波谱分析化合物7为3-氨基-4-(羟基甲基)-4，14-二甲基-9，19-环丙基-17-二甲基氨基-23-苯甲酰酯甾烷。化合物7的结构图如图2所示。

图2 化合物7的结构图

化合物8：白色固体粉末，ES-MS：[M+H]+=565，分子式C35H52O4N2，1H NMR(400 MHz，Chloroform-d)δ 7.71(d，J=7.4 Hz，1H)，7.57-7.30(m，2H)，7.27(s，2H)，4.54-4.24(m，1H)，3.97-3.72(m，1H)，2.31-2.20(m，1H)，2.11(s，1H)，2.09-2.00(m，2H)，1.95(dd，J=12.2，4.4 Hz，1H)，1.93-1.81(m，1H)，1.73(dt，J=23.6，11.7 Hz，2H)，1.62(d，J=13.0 Hz，1H)，1.59-1.52(m，1H)，1.52(d，J=8.0 Hz，2H)，1.50-1.40(m，2H)，1.35(d，J=15.6 Hz，2H)，1.28(s，1H)，1.25(s，3H)，1.17(d，J=10.4 Hz，3H)，1.13(d，J=6.1 Hz，3H)，1.01(q，J=9.3，7.3 Hz，4H)，0.99-0.86(m，3H)，0.88-0.78(m，9H)，0.78-0.64(m，1H)，0.58(d，J=3.9 Hz，1H)，0.41(d，J=4.0 Hz，1H)。13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ 171.52，167.28，135.24，131.50，128.73，126.91，65.88，57.07，51.05，48.01，47.60，46.38，45.98，42.61，42.03，32.40，32.19，30.16，29.83，28.52，26.16，25.89，25.69，21.21，21.17，20.61，19.51，19.38，14.29，11.74，10.96。13C NMR碳谱数据显示该化合物有35个碳，根据DEPT图显示该化合物含有7个CH3，9个CH2，11个CH，8个季碳。经上述波谱分析化合物8号为3-氨基-4，14-二甲基-9，19-环丙基-16-甲基丁酸甲酯-17-二甲基氨基-23-苯甲酰酯甾烷。化合物8的结构图如图3所示。

图3 化合物8的结构图

4 体外抗NSCLC肿瘤活性

采用CCK-8检测法[14]，检测化合物1-8对非小细胞肺癌A549的细胞增殖抑制作用，吉非替尼(gefitinib)为阳性对照组[14]。取对数生长期的A549细胞加入1 mL胰酶至培养箱消化3-5分钟，显微镜下观察细胞变圆后停止消化。用高糖DMEM培养基调整细胞数为5×104个/mL的密度接种到96孔板，每孔100 uL，培养24 h贴壁生长。实验设空白对照组，阴性对照组和给药组；给药组设5个不同浓度的样品(6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)，以浓度为1 %的DMSO为阴性对照组，以培养基作为空白对照组，每个浓度设3个复孔。给药100 uL后置37℃培养箱培养24 h后，观察细胞生长情况。弃去培养基，加入100 uL 10 %CCK-8溶液，在37℃，5 %培养箱孵育90分钟后；用酶标仪于450 nm处测定吸光度(A)值，根据吸光度A值计算抑制率，并用SPSS软件计算IC50。化合物1-8的IC50如表1所示。

表1 化合物1-8及Gefitinib的IC50

实验结果：这8个化合物都有抗非小细胞肺癌作用，化合物7抗非小细胞肺癌作用在这8个化合物中最强，化合物2作用最弱，后续可对化合物7进行进一步研究。以期获得更安全有效的抗非小细胞肺癌的药物。