hiPSCs分化的细胞和类器官在SARS-CoV-2感染研究上的应用

征月良

(临沂大学 生命科学学院，山东 临沂 276000)

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的传染病，能感染人体多种器官。为了研究人体细胞和器官感染SARS-CoV-2后的病理反应，可利用人的诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)分化成特定细胞和类器官，再通过病毒对这些细胞和类器官进行感染，从而进行此病毒的感染研究。

1 SARS-CoV-2、hiPSCs及类器官

SARS-CoV-2(2019-nCoV)为β属冠状病毒，是一种有包膜的RNA病毒，具刺突，通常呈球形，直径约60-140 nm。[1]SARS-CoV-2对宿主细胞的感染与血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)和跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2，TMPRSS2)有关。病毒通过其刺突蛋白(spike proteins，S蛋白)和细胞受体ACE2结合，促进病毒附着于细胞表面，TMPRSS2能切割病毒S蛋白，使得病毒和宿主细胞膜融合，导致病毒进入细胞。[2]

hiPSCs是一种多能干细胞，可由外周血单核细胞、成纤维细胞等细胞生成。从人体血液中分离出外周血单核细胞，使用仙台病毒重编程试剂盒在单核细胞中过表达4种Yamanaka因子，对细胞进行重编程，产生hiPSCs。hiPSCs呈集落状生长，核质比高，具有正常核型，能表达多能性标志NANOG、OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-81。hiPSCs有分化潜能，能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞。[3]在一定条件下，hiPSCs可分化为类器官。类器官是一种3D培养物，具有体内器官的一些结构和功能。在类器官生成过程中，先将hiPSCs分化成形态和大小均匀的胚状体(embryoid bodies，EB)，然后向培养基中添加特定生长因子，使EB分化为类器官。通过微流体共培养系统，对肝脏类器官和胰岛类器官进行共培养，它们均表现良好活性和功能，并发生相互作用，胰岛类器官在葡萄糖刺激下分泌胰岛素，胰岛素促进肝脏类器官利用葡萄糖。[4]

除了可用于器官功能研究外，hiPSCs分化的类器官也为病原体感染研究提供了一种有用模型。将人成纤维细胞诱导生成hiPSCs，然后将hiPSCs分化为脑类器官。脑类器官被乳头多瘤空泡病毒感染后，病毒颗粒主要存在于被感染细胞的核区室中，而且这种病毒的增殖性感染可长达3周。[5]在hiPSCs分化的脑类器官中，小胶质细胞具有吞噬活性和突触修剪功能。脑类器官被寨卡病毒感染后，促炎性因子的表达增加，发生炎症反应。小胶质细胞呈变形虫状，突触消除能力增强，发生过度突触修剪现象。[6]适当的SARS-CoV-2感染模型对于病毒侵染机制研究至关重要，当前，hiPSCs分化的呼吸道上皮细胞、肺类器官、神经系统细胞、脑类器官、心肌细胞、血管、肠类器官以及肾类器官已被应用于SARS-CoV-2感染研究。

2 hiPSCs分化的细胞和类器官在SARS-CoV-2感染研究上的应用

2.1 呼吸道上皮细胞和肺类器官

SARS-CoV-2在感染宿主细胞时，ACE2和TMPRSS2发挥重要作用。将hiPSCs分化为上皮基底样细胞，然后将这些细胞在气液界面上培养，生成呼吸道。该结构为复层上皮，有能摆动的纤毛，其顶端具粘液层，能产生粘液。这种呼吸道表达ACE2和TMPRSS2，能被SARS-CoV-2感染，并分泌促炎性因子，产生炎症反应。[7]这种呼吸道也可用于抗病毒药物的筛选，瑞德西韦和甲磺酸卡莫司他能减轻呼吸道被SARS-CoV-2感染的程度。[8]hiPSCs分化的呼吸道细胞受SARS-CoV-2感染后，细胞代谢过程被干扰，细胞因子如肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的表达上调，产生高水平的活性氧，导致细胞周期异常。[9]

人肺泡受SARS-CoV-2感染后，发生病理变化，气体交换功能受损。从患者直接获取肺泡细胞来研究SARS-CoV-2感染存在一定障碍，但可将hiPSCs分化成肺泡细胞，用于病毒感染研究。这种肺泡细胞被SARS-CoV-2感染后，基因转录发生变化，引起急性炎症反应。[10]SARS-CoV-2感染也触发肺泡细胞中肿瘤生长因子-β1的表达，诱导上皮细胞向间质细胞转化，导致肺泡细胞发生纤维化。[9]在被SARS-CoV-2感染的肺泡细胞中，微管被破坏，内质网数量增加，核糖体成分的合成也增加，对细胞增殖起负调控作用的基因表达上调，而与有氧呼吸相关的基因表达下调，细胞周期停止，肺泡细胞中这些变化促进了病毒的复制。[11]

在hiPSCs分化的肺类器官中，含有肺泡细胞、纤毛细胞和分泌细胞。此类器官能高效表达ACE2和TMPRSS2，易被SARS-CoV-2感染，并且感染率呈时间依赖性增加。受此病毒感染后，肺类器官中与免疫调节有关的基因如干扰素和趋化因子基因的表达上调，与炎症激活途径有关的基因如IL-18和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1基因的表达也上调，引起肺类器官的炎症发生和损伤。[12]

2.2 神经系统细胞和脑类器官

从患者直接获取神经系统的细胞来进行SARS-CoV-2感染研究存在一定障碍，但hiPSCs分化的神经系统细胞可用于此研究。在hiPSCs分化的小胶质细胞、星形胶质细胞和脉络丛上皮细胞中，小胶质细胞不被SARS-CoV-2感染，星形胶质细胞的感染程度低，而脉络丛上皮细胞的感染程度高。此病毒对脉络丛上皮细胞的趋向性感染会引起细胞合胞体的数量增加，并通过细胞间融合促进病毒的传播。SARS-CoV-2的感染导致脉络丛上皮细胞的基因转录失调，促炎性因子的表达增加，引起炎症反应，脉络丛上皮的正常屏障功能和分泌功能受损。[13]

视网膜是眼球壁的内层结构，在感受光刺激方面起重要作用。hiPSCs可分化为视网膜类器官(retinal organoids)，此类器官含视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)、视网膜祖细胞、无长突细胞和双极细胞。与视网膜祖细胞、无长突细胞和双极细胞相比，RGCs更易受SARS-CoV-2感染。IL-33与炎症发生相关，Janus激酶-信号转导子与转录激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)信号通路也参与炎症发生和抗病毒反应。视网膜类器官被SARS-CoV-2感染后，IL-33表达及JAK-STAT通路的基因表达上调，而与DNA修复相关的基因表达下调。SARS-CoV-2对视网膜类器官的感染与ACE2有关，使用ACE2抗体可阻断此病毒对视网膜类器官的感染。[14]

hiPSCs可分化为神经祖细胞，在未被SARS-CoV-2感染的神经祖细胞中，富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61，Cyr61)的表达水平低，但在被感染细胞中，Cyr61的表达水平高。Cyr61的表达水平升高可增强病毒的毒性并诱导炎症反应。[15]将人神经祖细胞在旋转振荡条件下培养，可形成脑球结构。SARS-CoV-2感染此脑球后，在受感染的神经元中，病毒复制活跃，引发细胞裂解。[16]在hiPSCs分化的脑类器官中，含有充满液体的脑室，有表达NESTIN的神经祖细胞和表达TUJ1的神经元。脑类器官被SARS-CoV-2感染后，出现细胞融合现象，释放出病毒粒子。[17]在脑类器官中，相比于星形胶质细胞和神经祖细胞，神经元更易受SARS-CoV-2感染。脑类器官被此病毒感染后，补体系统的基因表达增强，caspase-3的表达上调，B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)和BCL-2相关X蛋白的表达下调，神经元发生突触丢失现象。[12]与培养15天的脑类器官相比，培养60天的脑类器官更易受SARS-CoV-2感染。Tau是一种微管结合蛋白，位于神经元轴突，起稳定微管并促进轴突生长作用。脑类器官被SARS-CoV-2感染后，神经元中Tau发生过度磷酸化，Tau被错运至神经元胞体中，导致Tau定位异常。在被SARS-CoV-2感染的神经元中，出现核固缩和DNA片段化现象。[18]

2.3 心肌细胞

hiPSCs分化的心肌细胞(iPSC-derived cardiomyocytes，iCMs)可用于SARS-CoV-2感染研究。将hiPSCs分化为iCMs、心脏成纤维细胞和内皮细胞后，用SARS-CoV-2进行感染，发现iCMs可被感染，但另二种分化细胞未被感染。[19]SARS-CoV-2进入iCMs后，在溶酶体样囊泡中组装，并通过胞吐作用排出大量病毒粒子。[20]除了能直接感染iCMs外，含有病毒RNA的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是病毒感染iCMs的间接途径。受SARS-CoV-2感染的细胞能分泌携带病毒RNA的EVs，这些EVs可被iCMs摄入，导致iCMs被感染。[21]在被SARS-CoV-2感染的iCMs中，TNF-α的表达水平升高，而TNF-α水平上升反过来又促进病毒进入iCMs。[22]

hiPSCs分化的iCMs受SARS-CoV-2感染后，染色质可及性途径发生上调，能量生成途径发生下调，细胞代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解，细胞的电生理活性受损。[20]在被SARS-CoV-2感染的iCMs中，出现双链RNA，这种RNA是病毒感染细胞后形成的中间体。SARS-CoV-2感染会破坏细胞间缝隙连接，损害心肌细胞的兴奋-收缩耦联。[23]在被SARS-CoV-2感染的iCMs中，趋化因子(C-X-C基序)配体1(chemokine(C-X-C motif)ligand 1，CXCL1)、CXCL2、IL-6和IL-8的表达上调，细胞发生病变，聚成葡萄串状，出现收缩和起皱，从培养皿上脱落。[24]另外，受SARS-CoV-2感染的iCMs发生碎片化，肌原纤维断裂，导致细胞的收缩功能发生障碍。[19]

hiPSCs分化的iCMs可用于评估药物的抗病毒作用。心肌细胞表达大麻素受体，大麻素通过对促炎性因子的释放起负调节作用而具有抗炎特性。在SARS-CoV-2感染的iCMs中，大麻素激动剂WIN55，212-2能降低被感染细胞释放促炎性因子的水平，从而减轻iCMs的损伤。[25]瑞德西韦和羟氯喹有抗SARS-CoV-2的作用，能防止iCMs被此病毒感染。[26-27]Sigma-1受体(Sigma-1 receptor，S1R)是一种在心肌细胞中广泛表达的伴侣蛋白，S1R的拮抗剂NE-100可抑制iCMs的S1R活性，减轻SARS-CoV-2的感染。[28]

2.4 血管

血管是血液流动的管道，心脏泵出的血液，通过血管运输到全身组织和器官，以满足机体生命活动的需要。hiPSCs可分化为血管，这种人造血管与人体内血管相似，具有管腔和基底膜，有表达CD31的内皮细胞和表达PDGFR的周细胞。人造血管被SARS-CoV-2感染后，病毒复制活跃，产生新的病毒粒子。SARS-CoV-2对人造血管的感染与ACE2有关，重组可溶性人ACE2(human recombinant soluble ACE2，hrsACE2)可抑制SARS-CoV-2对人造血管的感染，而且hrsACE2对人造血管没有毒性，从而为预防这种病毒的感染提供了一种重要方法。[29]

2.5 肠类器官

hiPSCs分化的肠类器官(human iPSC-derived intestinal organoids，HIO)也是SARS-CoV-2感染研究的一种有用模型。HIO含有具微绒毛的肠上皮细胞，被SARS-CoV-2感染后，在受感染细胞内部和邻近细胞的刷状缘处存在病毒颗粒。随着感染时间的推移，病毒出现复制和传播。在被感染的HIO近端区域，小肠上皮特异性标记的表达降低，干扰素信号通路上调，而在被感染的HIO远端区域，结肠上皮特异性标记的表达提高，出现未折叠蛋白反应，核因子κB信号通路上调，被感染的HIO发生炎症反应。[30]在HIO中，内分泌细胞和帕内特细胞也能被SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2感染不仅可能影响HIO对代谢产物的吸收，还可能影响其激素分泌和局部防御功能。HIO被SARS-CoV-2感染后，病毒能在整个HIO中传播，导致HIO退化。[31]

2.6 肾类器官

将hiPSCs分化为肾类器官，这种类器官有肾单位样结构，能被SARS-CoV-2感染。在被感染的肾类器官中，近端肾小管上皮细胞和足细胞中MYC、E2F4和SRF的表达增加，引起细胞应激反应，类器官发生炎症反应和损伤。肾类器官被SARS-CoV-2感染后，I型胶原蛋白的表达增加，引起胶原沉积现象。在近端肾小管上皮细胞和间质细胞之间，以及在足细胞与间质细胞之间，发生细胞间相互作用，激活了纤维化相关信号通路，导致肾类器官发生纤维化。[32]在肾类器官中，SARS-CoV-2能感染近端肾小管上皮细胞，而内皮细胞不被感染。被此病毒感染后，近端肾小管上皮细胞的标记物翅荚百脉根凝集素的表达中断，caspase-3的表达增加，细胞出现肿胀和核固缩现象。LCB1蛋白能结合SARS-CoV-2的受体结合结构域，阻止此结构域与细胞的ACE2发生相互作用，阻断此病毒对肾类器官的感染，从而为防止SARS-CoV-2感染提供了一种新策略。[33]

3 结语

hiPSCs分化的细胞和类器官作为一种重要的材料来源，在SARS-CoV-2感染研究上具有重要应用价值，可以克服直接用患者的细胞和器官来进行病毒感染研究的障碍。近年来的研究表明，这些细胞和类器官可成功用于SARS-CoV-2感染研究，病毒不仅能感染这些细胞和类器官，而且会影响它们的正常活性和功能。但是，hiPSCs分化的类器官应用于SARS-CoV-2感染研究时，也存在一些缺陷。这些类器官类似于胎儿器官，而成体器官和胎儿器官在对病毒的易感性上可能存在一些差异，用hiPSCs分化的类器官来进行SARS-CoV-2感染研究，如何全面反映成体器官被感染情况，需要加以研究。另外，与体内器官相比，hiPSCs分化的类器官缺乏一些种类的细胞，如何产生细胞种类齐全的类器官，研究不同种类细胞之间以及不同类器官之间的相互作用对SARS-CoV-2感染的影响，从而更全面反映器官被SARS-CoV-2感染的情况，需要进一步研究。另外，除了呼吸道上皮细胞、肺类器官、神经系统细胞、脑类器官、心肌细胞、血管、肠类器官以及肾类器官外，如果hiPSCs分化的其它种类细胞和类器官用于SARS-CoV-2感染研究，病毒感染对它们有何影响，也有待加以研究。