三华李-木瓜复合果醋的发酵工艺研究

苏彩荣，余森艳，黎兰明，李秀秀，覃瑶双，农天霸

（广西民族师范学院化学与生物工程学院，广西 崇左 532200）

0 引言

三华李属蔷薇科李属，主要在广东、广西等地区种植，广西最大的三华李生产基地是贺州市八步区[1]。成熟的三华李外观呈圆形，果肉呈紫红色，肉厚核小、脆甜可口、风味独特。三华李富含矿物质、维生素、有机酸等多种营养物质，此外还含有钙、铁、磷、核黄素、维C、多酚类物质和类胡萝卜素[2]。三华李主要用于鲜食，在华南地区盛行将三华李做成酸嘢，部分加工成果脯[3]、果汁饮料[4]等产品，但将其用于果醋酿造还鲜有报道。木瓜属番木瓜科番木瓜属，广西是我国木瓜的主要产区，果实为橙色或橙红色，果肉多汁味甜，含有丰富的蛋白质、维生素、有机酸等多种成分，也含有丰富的超氧化物歧化酶，具有抗衰老、抗癌、防辐射等作用，是兼具营养价值与药用价值的水果之一[5]。

果醋是一种以水果或者多种水果加工下脚料为主要原料，经过酒精发酵和醋酸发酵2 段发酵工艺酿造而成的酸性饮品[6-7]。果醋营养丰富、风味优良，具有促消化、抗氧化、促进新陈代谢、调节酸碱平衡和降血脂等功效[8-10]，是集营养、保健、食疗等功能为一体的新型饮品[11]。三华李与木瓜均不耐贮藏，鲜销有限，将2 种原料结合制成三华李-木瓜复合果醋，既能满足消费者对健康果醋饮品的追求，增加复合果醋的花色品种，又可突破水果盛产带来的“鲜销瓶颈”，提升三华李和木瓜的经济附加值，培育和拉动三华李与木瓜产业的健康可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三华李、木瓜，购自崇左农贸市场；果酒酵母、绵白糖，安琪酵母（崇左） 有限公司提供；果醋菌，烟台帝伯士自酿有限公司提供；75%食用酒精，河南汉永酒精有限公司提供；0.05 mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液，飞净生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

JYZ-E3C 型榨汁机，九阳股份有限公司产品；LRH-400A 型生化培养箱，广东泰宏君科学仪器股份有限公司产品；YP5002 型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司产品；PAL-1 型手持糖度计，深圳市卓越仪器仪表有限公司产品；酒精计，浙江力辰仪器科技有限公司产品；HWS-26 型电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司产品；BD-320HEM型冰箱，青岛海尔特种电冰柜有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

①三华李→清洗→去核→切块→热烫→三华李果浆；

②木瓜→清洗→去籽→切块→热烫→打浆→木瓜浆；

①+②→调配→调糖→杀菌、冷却→酒精发酵→过滤→调整酒精度→过滤→杀菌→成品。

1.3.2 操作要点

（1） 三华李果浆的制备。挑选成熟适度、无霉变腐烂的新鲜市售三华李，经清洗、去核、切块后热烫90 s，再按三华李与水质量比1∶1 打浆，获得三华李果浆备用。

（2） 木瓜浆的制备。选择八、九成熟的新鲜木瓜，清洗、去籽、切块后热烫90 s，以钝化木瓜蛋白酶活性，再按木瓜与水质量比1∶1 打浆，获得木瓜浆备用。

（3） 调配、调糖。将制备好的三华李果浆、木瓜浆按照一定的质量比例混合，再用绵白糖调整初始糖度至适宜范围。

（4） 杀菌、冷却。将调糖后的三华李-木瓜复合果浆于100 ℃条件下灭菌5 min，冷却备用。

（5） 酒精发酵。通过前期试验确定三华李-木瓜复合果酒发酵的条件为三华李果浆与木瓜浆的质量比例1∶1，酵母添加量0.3%，发酵温度27 ℃，初始糖度22%，发酵时间5 d，在此条件下发酵所得的三华李-木瓜复合果酒具有较好的风味，酒体呈橙色，酒香浓郁、醇厚爽口。

（6） 调整酒精度。利用酒精计测定酒精度，将复合果酒用无菌水及食用酒精调整到醋酸发酵所需要的酒精度。

（7） 醋酸发酵。在调整酒精度的三华李-木瓜复合果酒中加入果醋菌，敞口静置进行醋酸发酵，每天搅拌2～3 次，以提高溶氧量。

（8） 杀菌。将发酵结束的三华李-木瓜复合果醋过滤后于95～100 ℃条件下杀菌约10 min，然后迅速冷却至常温。

1.4 醋酸发酵单因素试验设计

以初始酒精度、果醋菌添加量、发酵温度及发酵时间4 个因素进行醋酸发酵阶段的单因素试验，设计各因素水平为初始酒精度6%，7%，8%，9%，10% （V/V）；果醋菌添加量1%，2%，3%，4%，5%；发酵温度30，32，34，36，38 ℃；发酵时间5，7，9，11，13 d。当研究其中1 个因素时，其余的3 个因素取各水平的中间值，以总酸为指标，研究这4 个因素对醋酸发酵的影响。

1.5 醋酸发酵工艺优化响应面优化试验

在醋酸发酵单因素试验的基础上，以Y 总酸（以乙酸计，质量浓度g/100 mL） 为响应值，根据Box-benhnken 设计原理，以初始酒精度（A）、果醋菌添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D） 为因素设计四因素三水平的响应面试验，确定复合果醋的最佳发酵工艺条件。

1.6 数据处理与分析

利用Origin2021 软件完成单因素试验作图，运用Design Expert 8.0.6 软件完成响应面试验作图及数据处理与分析。

1.7 理化成分测定

酒精度的测定：使用酒精计测定。

糖度的测定：使用手持糖度计测定。

总酸测定：采用酸碱滴定法（以乙酸计，参照GB 12456—2021 食品安全国家标准食品中总酸的测定）。

2 结果与分析

2.1 醋酸发酵最佳工艺条件的确定

2.1.1 初始酒精度的确定

初始酒精度对醋酸发酵的影响见图1。

图1 初始酒精度对醋酸发酵的影响

由图1 可知，三华李-木瓜复合果醋产品的总酸含量在初始酒精度为6%～9%（V/V） 范围内呈升高的趋势；当初始酒精度超过9%（V/V） 时，总酸含量开始下降。这可能是因为酒精度过高会抑制果醋菌的生长代谢，降低其活力，导致发酵结束时总酸的含量偏低[12]。可见，酒精度的高低会影响总酸产量。因此，选择该因素进行响应面试验的3 个水平为8%，9%，10%（V/V）。

2.1.2 果醋菌添加量的确定

果醋菌添加量对醋酸发酵的影响见图2。

图2 果醋菌添加量对醋酸发酵的影响

由图2 可知，当果醋菌添加量为3%时，总酸含量达到最大；果醋菌添加量为1%～3%时，总酸含量逐渐升高，超过3%时，总酸含量开始降低。原因可能是果醋菌添加量较低时，菌体生长速度慢，发酵液中的酒精不能在短时间内尽快转化为醋酸[13]。当果醋菌添加量在适当的范围内及溶氧量大时，有利于醋酸的产生，而果醋菌添加量过多时，一方面果醋菌的生长繁殖会消耗过多的营养物质；另一方面会导致溶氧量降低使醋酸生成量下降[14]。因此，选择该因素进行响应面试验的3 个水平为2%，3%，4%。

2.1.3 发酵温度的确定

发酵温度对醋酸发酵的影响见图3。

图3 发酵温度对醋酸发酵的影响

由图3 可知，发酵温度低于34 ℃时，总酸含量随发酵温度增加而升高；当发酵温度超过34 ℃时，总酸含量呈下降趋势。这可能是因为适宜的温度有利于果醋菌生长繁殖和产酸；当发酵温度偏低或偏高时，果醋菌的酶活性被抑制，酒精转化为醋酸的能力下降[15]。因此，选择该因素进行响应面试验的3个水平为32，34，36 ℃。

2.1.4 发酵时间的确定

发酵时间对醋酸发酵的影响见图4。

图4 发酵时间对醋酸发酵的影响

由图4 可知，三华李-木瓜复合果醋在发酵过程中，总酸含量随着发酵时间的延长呈先升高后缓慢降低的趋势，当发酵时间为9 d 时总酸含量达到最高。发酵初期总酸含量低，这可能是因为发酵时间太短，发酵不充分，随着时间的推移，发酵液的总酸含量趋于平缓，表明醋酸发酵基本结束[16]。因此，选择该因素进行响应面试验的3 个水平为9，11，13 d。

2.2 醋酸发酵工艺响应面法优化试验结果与分析

根据Box-behnken 中心组合试验设计原理[17]，在醋酸发酵单因素试验基础上，设计醋酸发酵响应面试验因素水平（见表1），并以Y总酸为响应值，进行四因素三水平的响应面试验设计（见表2） 和回归分析与结果（见表3）。

表1 醋酸发酵响应面试验因素与水平设计

表2 醋酸发酵响应面试验方案及结果

表3 回归分析与结果

醋酸发酵响应面试验因素与水平设计见表1，醋酸发酵响应面试验方案及结果见表2，回归分析与结果见表3。

利用Design Expert 8.0.6 软件进行回归分析，得到的回归方程式为：

由表3 可知，模型的p＜0.000 1＜0.01，表明模型方程极显著，说明试验方法可行可靠；失拟项p=0.312 5＞0.05，失拟项不显著，说明该模型的拟合度较好，该方程能够很好地反映初始酒精度、果醋菌添加量、发酵温度、发酵时间和总酸之间的准确关系，可以利用回归方程式得出三华李-木瓜复合果醋的最佳工艺条件，回归分析结果显示R2=0.956 9，R2Adj=0.913 8，两者相差＜0.2，说明预测值与真实值有很好的相关性。一次项A对总酸有极显著影响，C对总酸有显著影响；交互项BD对总酸有极显著影响，AC、BC对总酸有显著影响；二次项A2，B2，C2，D2对总酸有极显著影响，其他各因素对总酸影响不显著（p＞0.05）。

2.3 三华李-木瓜复合果醋工艺优化响应面图

从Design Expert 8.0.6.1 响应面分析软件中得到两两因素间的三维响应曲面图。曲面图可直接反映各因素交互作用对果醋总酸的影响，曲面的坡度越陡，说明该因素对果醋发酵过程的影响越大[18-19]。

各因素交互作用对总酸影响的曲面图见图5。

图5 各因素交互作用对总酸影响的曲面图

由图5 可知，总体上，总酸含量随着4 个因素的增加先上升后下降，初始酒精度、果醋菌添加量、发酵温度和发酵时间4 个因素之间存在交互作用。其中，总酸含量受果醋菌添加量和发酵时间交互作用强，对总酸的影响极显著；初始酒精度和发酵温度、果醋菌添加量和发酵温度的交互作用较强，对总酸的影响显著。

2.4 验证试验

根据响应面分析试验，结合回归方程分析得出优化的三华李-木瓜复合果醋最佳发酵工艺条件为初始酒精度9.26%（V/V），果醋菌添加量2.98%，发酵温度33.62 ℃，发酵时间11.12 d，在该预测条件下，果醋的总酸为5.07 g/100 mL。为了验证试验，使结果更准确，根据实际情况，对响应面试验得出的最佳工艺条件进行如下调整：初始酒精度9%（V/V），果醋菌添加量3%，发酵温度34 ℃，发酵时间11 d，在此发酵工艺条件下重复三华李-木瓜复合果醋发酵3 次，得出三华李-木瓜复合果醋的平均总酸为5.17 g/100 mL，该值与预测值接近，两者之间的相对误差只有0.2%，说明该模型能够很好地反映三华李-木瓜复合果醋发酵的实际情况，因此使用该方法分析三华李-木瓜复合果醋得到的数据是可靠的。

3 结论

以三华李和木瓜为原料，依次进行酒精发酵与醋酸发酵，通过单因素试验和响应面分析试验，对三华李-木瓜复合果醋在醋酸发酵过程中的主要工艺参数进行优化，得出复合果醋的最佳发酵工艺条件为初始酒精度9%（V/V），果醋菌添加量3%，发酵温度34 ℃，发酵时间11 d，在该条件下，果醋的总酸含量达到5.17 g/100 mL，产品的色泽呈棕红色，透明澄清、酸味柔和、果香协调。三华李-木瓜复合果醋的研发既可延伸三华李与木瓜的加工产业链，提升三华李和木瓜的经济附加值，又可增加果醋花色品种，为果醋产业健康发展提供一定的理论参考。