超声辅助热水浸提法制备锦灯笼果实多糖的研究

冯晓阳，徐丹鸿，杨 迪，刘锦田

（1.黑龙江生态工程职业学院生物技术系，黑龙江 哈尔滨 150025；2.中国铁路哈尔滨局集团有限公司哈尔滨铁路疾病预防控制中心，黑龙江 哈尔滨 150006）

锦灯笼（红菇娘） 素有“草本水果”之称，不仅富含氨基酸、蛋白质、纤维素、脂肪等营养物质，还含有丰富的化学成分，包括甾体类、黄酮类、萜类、生物碱类、苯丙素类、糖苷类、酚酸类等[1]，迄今已从锦灯笼中分离鉴定出大约159 种化合物[2]。其全草及果实、根均可入药，始载于《神农本草经》，其后历代本草多有收载，是2005 年版药典中规定的药用部位。多糖是锦灯笼属植物的主要有效成分之一，具有抗氧化、降血糖、降血脂、免疫调节、改善肠道微生态等多种生物活性[2]。目前，锦灯笼多作为水果供当地人食用，对其有益成分的提取和精深加工，在食品及生物医药领域将会有广阔的应用前景[3]。以药食两用、苦寒无毒的草本植物锦灯笼为原料，对锦灯笼果实多糖采用超声波辅助热水法提取，对提取条件进行优化，并采用三氯乙酸法对制得的粗多糖进行脱蛋白处理，以期为工业化大规模提取锦灯笼多糖提供依据和参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

锦灯笼，购自黑龙江省哈尔滨。

1.2 仪器

DHG-9240 型电热恒温鼓风干燥箱、HBS-5 型真空泵，上海一恒科技有限公司产品；ALC-1104 型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；RE-52A 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；HHS 型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；TDL- 5-W 型台式低速离心机，湖南星科科学仪器有限公司产品；TV-1901 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司产品；BCD-238（L） 型美菱电冰箱，合肥美菱股份有限公司产品；KQ300-VDB 型超声波，江苏省昆山市超声仪器有限公司产品。

1.3 试剂

无水乙醇、无水乙醚、石油醚、丙酮、浓硫酸、重蒸苯酚、葡萄糖、考马斯亮蓝、牛血清白蛋白、三氯乙酸，以上试剂均为分析纯化学试剂。

2 试验方法

2.1 材料预处理

新鲜的锦灯笼果实去腐烂后清洗，于60 ℃条件下烘干，粉碎过筛（40 目），石油醚脱脂处理后备用。

2.2 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定[4]。

2.3 多糖提取率

2.4 蛋白质含量测定方法

采用考马斯亮蓝法测定[5]。

2.5 超声辅助热水浸提法提取锦灯笼果实多糖工艺的研究

称取相同质量的经脱脂处理后的锦灯笼果实粉末，采用超声波辅助热水浸提法提取水溶性多糖，研究超声功率、超声温度、超声时间、料液比对多糖得率的影响。并对4 个因素做三水平的正交试验，均以多糖提取率为指标。

锦灯笼果实多糖提取的单因素试验水平见表1。

表1 锦灯笼果实多糖提取的单因素试验水平

2.6 三氯乙酸除蛋白法

依次取锦灯笼果实粗多糖液20 mL，加入等体积的三氯乙酸溶液，其质量分数分别为1%，2%，3%，4%，5%，6%，振摇30 min，于4 ℃条件下静置过夜，离心（转速4 000 r/min，时间5 min） 弃去沉淀，收集上清液，测定多糖保留率和蛋白脱除率。

3 结果与分析

3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，由标准曲线图得回归方程：Y=0.009 6X-0.004 61，R2=0.999 2.

3.2 蛋白质标准曲线的绘制

以牛血清蛋白质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，由标准曲线图得回归方程：Y=0.000 6X+0.068 7，R2=0.998 5.

3.3 超声辅助热水浸提法提取锦灯笼果实多糖工艺的研究

3.3.1 超声功率对锦灯笼果实多糖得率的影响

分别称取相同质量的脱脂锦灯笼果实粉末，料液比为1∶15，超声温度为60 ℃的条件下，分别于超声功率为140，160，180，200，220 W 的条件下超声处理30 min，研究不同超声功率对多糖得率的影响。

超声功率对锦灯笼果多糖得率的影响见图1。

图1 超声功率对锦灯笼果多糖得率的影响

由图1 可知，锦灯笼果实多糖提取率均随着超声功率的升高先增加后减少。果实多糖在超声功率为200 W 时，提取率达到最大值，超过200 W 时，多糖提取率开始下降，这是由于超声功率越大，其机械振动强度越大，对锦灯笼果实多糖的破碎作用越强，进而导致多糖分子糖苷键的断裂，影响多糖得率。

3.3.2 超声温度对锦灯笼果实多糖提取率的影响

分别称取相同质量的脱脂锦灯笼果实粉，料液比为1∶15，超声功率180 W，分别于超声温度为40，50，60，70，80 ℃的条件下超声处理30 min，研究不同超声温度对多糖得率的影响。

超声温度对锦灯笼果实多糖得率的影响见图2。

图2 超声温度对锦灯笼果实多糖得率的影响

由图2 可知，随着超声温度的升高，多糖得率随之增加，在超声辅助提取，超声温度达到80 ℃时，多糖提取率达到最高，但温度过高会影响多糖的活性，同时对仪器设备的要求也提高。

3.3.3 超声时间对锦灯笼果多糖提取率的影响

分别称取相同质量的脱脂锦灯笼果实粉末，料液比为1∶15，超声功率180 W，分别于超声温度为60 ℃的条件下超声处理30，40，50，60，70 min，研究不同超声时间对多糖得率的影响。

超声时间对锦灯笼果实多糖得率的影响见图3。

图3 超声时间对锦灯笼果实多糖得率的影响

由图3 可知，超声时间为30～50 min 时，随着超声处理时间的延长而升高，果实多糖在超声处理时间为50 min 时，提取率达到最大值。超声处理具有较强的剪切作用，长时间处理会使大分子的糖苷键断裂，从而影响多糖得率，使锦灯笼果实多糖得率呈下降趋势。

3.3.4 料液比对锦灯笼果实多糖提取率的影响

分别称取相同质量的脱脂锦灯笼果实粉末，在料液比为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，超声功率180 W，超声温度为60 ℃的条件下超声处理30 min，研究不同料液比对多糖得率的影响。

料液比对锦灯笼果实多糖得率的影响见图4。

图4 料液比对锦灯笼果实多糖得率的影响

由图4 可知，随着提取剂水用量的增大，锦灯笼果实多糖的提取率也随之增加，在用水量较低时，不利于多糖物质的溶出，得率较低，但用水量过大会增加浓缩成本。因此，在选择料液比时需考虑工艺的实用性，料液比应适宜。

3.3.5 优化超声法提取锦灯笼果实多糖工艺

在单因素试验的基础上，综合考虑多糖得率、减少能耗及可操作性，选取超声功率、超声温度、超声时间、料液比进行正交试验，提取次数1 次。

锦灯笼果实多糖超声提取L9（34）正交试验设计与结果见表2。

表2 锦灯笼果实多糖超声提取L9（34）正交试验设计与结果

由极差分析可知，影响多糖提取率各因素的主次关系为超声功率＞超声温度＞超声时间＞料液比，得出超声法提取锦灯笼果多糖的最佳工艺条件为超声功率200 W，超声温度80 ℃，超声处理40 min，料液比1∶20，锦灯笼果实多糖得率可达到3.72%。

3.6 三氯乙酸除蛋白法

TCA 法脱蛋白效果见图5。

图5 TCA 法脱蛋白效果

结果表明，随着三氯乙酸质量分数的增加，脱蛋白效果增强，同时多糖含量保留率也随着三氯乙酸质量分数的增加而减少，三氯乙酸法脱蛋白时反应较为剧烈，当三氯乙酸质量分数超过4%时，多糖保留率减少的速率增大，其原因可能是三氯乙酸质量分数升高，对多糖有破坏作用。综合考虑，蛋白质脱除率和多糖得率及三氯醋酸可能对多糖结构的影响，选择三氯乙酸最佳质量分数为4%，此时蛋白质的脱除率为40.26%，多糖保留率为81.71%。

4 结论

探索了超声法辅助热水浸提法制备锦灯笼多糖的最佳提取工艺路线。结果表明，在超声功率200 W，超声温度80 ℃，超声处理40 min，料液比1∶20 条件下，锦灯笼果实多糖得率可达到3.72%。锦灯笼果实粗多糖在三氯乙酸质量分数为4%时，蛋白质的脱除率为40.26%，多糖损失率较低，多糖得率为81.71%。锦灯笼粗多糖含有一定量的蛋白质和色素，有关锦灯笼多糖结构及生理活性的研究后期需要进一步探讨。