火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽的酶解制备工艺研究

魏连会，董 艳，姬妍茹，石 杰，李国巍，张正海，杨庆丽，高 媛，潘 静

（黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163319）

火麻（Cannabis sativaL.） 俗称为大麻，在我国又称为火麻，是大麻科大麻属一年生草本植物，火麻属低毒大麻，因其四氢大麻酚含量低于0.3%，已不具备毒品利用价值。火麻全身都是宝，火麻的皮、杆、根、籽和叶都可开发利用，产业涉及纺织、食品、制药、能源和建材等领域[1]。目前，许多发达国家都在大力开发利用火麻，尤其是以火麻籽功能食品的研究备受关注。火麻籽矿物质含量丰富，含有蛋白质（20%～25%）、膳食纤维（10%～15%）、脂类（25%～35%）、碳水化合物（20%～30%），是自古以来人们重要的营养源[2]。火麻籽蛋白作为一种新型蛋白资源，具有很高的开发研究价值。

人体嘌呤代谢异常会引发高尿酸血症，最后发展为痛风，痛风患者的数量逐年上升[3-4]。同时体内嘌呤代谢紊乱会使尿酸水平升高，引发高尿酸血症[5-7]。现有的化学药物对身体造成了极大伤害，寻求食源性黄嘌呤氧化酶抑制剂具有重要意义[8-10]。火麻仁蛋白营养价值高，开发利用率低，因此对其进行火麻仁降尿酸肽研究探讨，有利于增加产品的附加值，带动产业发展及其种植结构调整[11-12]。因此，以火麻蛋白为原料，研究火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽的酶解制备工艺，以延长火麻产业链条。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

火麻仁蛋白粉，黑龙江省科学院大庆分院自制；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶，夏盛酶生物技术有限公司提供；黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶，Sigma 公司提供。

1.2 仪器设备

FA1104N 型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司产品；HH-1 型数显恒温水浴锅，金坛市盛蓝仪器制造有限公司产品；DHG-9070A 型鼓风干燥箱，上海飞跃实验仪器有限公司产品；MS300 型加热式恒温电动磁力搅拌器，上海般特公司产品；BCD-215TBDZ 型冰箱，青岛海尔股份有限公司产品；Epoch 型酶标仪，美国BioTek 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 火麻仁蛋白酶解产物的制备

基本工艺：火麻仁蛋白粉→加水调整料液比→调pH 值和温度→加蛋白酶酶解→灭酶（5 min） →离心（转速5 000 r/min，时间20 min） →上清液→真空低温冷冻干燥→火麻仁肽粉。

1.3.2 酶解用蛋白酶的筛选

料液比1∶5，酶解时间4 h，设定酶最适pH值，温度（T），对火麻仁蛋白进行酶解。设定酶用量5 000 U/g，确定火麻蛋白XOD 抑制肽最佳酶种类。

蛋白酶最适条件见表1。

表1 蛋白酶最适条件

1.3.3 单因素试验

为了能得到火麻仁肽以XOD 抑制活性指标，进一步考查酶解温度（T）、蛋白酶用量和酶解时间这3 个因素的影响。

1.3.4 正交试验工艺优化

根据单因素试验结果设计正交优化试验，确定酶解制备火麻仁蛋白XOD 抑制肽的最佳工艺。

酶解条件因素与水平设计见表2。

表2 酶解条件因素与水平设计

1.3.5 水解度测定

采用福林酚比色法，按照公式计算：

式中：N0——不同浓度火麻蛋白溶液氮含量，mg/mL；

N1——蛋白酶水解前可溶性氮含量，mg/mL；

N2——蛋白酶水解后可溶性氮含量，mg/mL。

1.3.6 火麻仁肽XOD 抑制活性测定

参考邹琳等人[13]的文献进行火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽活性测定研究。

2 结果与分析

2.1 酶解用蛋白酶的筛选结果

采用不同蛋白酶酶解火麻仁蛋白，中性蛋白酶的XOD 抑制活性、水解度均最高，分别达到73.34%和19.5%。试验的中性蛋白酶主要含有内肽酶活性，含有少量的氨肽酶和羧肽酶活性。内肽酶的作用点位于蛋白质的内部，远离其N 端和C 端。这些酶共同作用于蛋白质分子中的肽键，将蛋白质水解成低聚肽及氨基酸。因此，选用中性蛋白酶进行下一步优化制备工艺。

不同蛋白酶对XOD 抑制活性和水解度的影响见表3。

表3 不同蛋白酶对XOD 抑制活性和水解度的影响

2.2 中性蛋白酶的单因素试验结果

研究中性蛋白酶用量、酶解温度和酶解时间3 个因素对酶解制备火麻仁蛋白XOD 抑制肽的影响。

2.2.1 中性蛋白酶用量对酶解效果的影响

在料液比为1∶5，中性蛋白酶pH 值为6.5，酶解温度50 ℃条件下酶解火麻仁蛋白4.0 h，考查中性蛋白酶用量分别为3 000，4 000，5 000，6 000，7 000 U/g 时对XOD 抑制活性。

中性蛋白酶用量对酶解效果的影响见图1。

图1 中性蛋白酶用量对酶解效果的影响

由图1 可知，XOD 抑制活性随着酶用量的增加而上升。当酶用量超过5 000 U/g 后，XOD 抑制活性变化不大，考虑节约成本，酶用量以5 000 U/g为最佳。

2.2.2 中性蛋白酶酶解温度对酶解效果的影响

在料液比为1∶5，中性蛋白酶pH 值为6.5，蛋白酶用量5 000 U/g 条件下酶解火麻仁蛋白4.0 h，考查中性蛋白酶酶解温度分别为40，45，50，55，60 ℃时对XOD 抑制活性。

中性蛋白酶酶解温度对酶解效果的影响见图2。

图2 中性蛋白酶酶解温度对酶解效果的影响

由图2 可知，XOD 抑制活性随着酶解温度的递增也逐渐增大。当酶解温度大于50 ℃时，随着酶解温度的增加，XOD 抑制活性趋于平稳。因此，中性蛋白酶最佳酶解温度为50 ℃。

2.2.3 中性蛋白酶酶解时间对酶解效果的影响

在料液比为1∶5，中性蛋白酶pH 值6.5，蛋白酶用量5 000 U/g，酶解温度50 ℃条件下酶解火麻仁蛋白，考查中性蛋白酶酶解时间分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h 时对XOD 抑制活性。

中性蛋白酶酶解时间对酶解效果的影响见图3。

图3 中性蛋白酶酶解时间对酶解效果的影响

由图3 可知，XOD 抑制活性随着酶解时间的延长也逐渐增大。当酶解时间大于4.0 h 时，XOD 抑制活性趋于平稳。因此，中性蛋白酶最佳酶解时间为4.0 h。

2.3 正交试验结果

根据单因素试验结果，料液比1∶5，pH 值6.5对中性蛋白酶酶解火麻蛋白的各影响因子进行正交试验，确定火麻仁的最佳条件。

酶解条件正交试验见表4。

表4 酶解条件正交试验

由表4 可知，料水比1∶5，pH 值6.5 条件下最优水平组合为A3B2C3，即酶用量6 000 U/g，酶解温度50 ℃，酶解时间5 h，酶解XOD 抑制活性最佳，通过极差分析，各因素影响的主次顺序为A＞C＞B。通过对最优组合A3B2C3验证试验，在酶用量为6 000 U/g，酶解温度50 ℃，酶解时间5 h，蛋白酶酶解火麻蛋白的XOD 抑制活性为78.98%。

3 结论

试验确定了火麻仁蛋白黄嘌呤氧化酶抑制肽的最佳工艺为采用中性蛋白酶，在pH 值6.5，料液比1∶5，酶用量6 000 U/g，酶解温度50 ℃，酶解时间5 h 条件下，XOD 抑制活性为78.98%，火麻仁蛋白是制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的优质来源，火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备，增加了火麻蛋白的附加值，延伸了火麻产业链条。