风化煤与褐煤转化生物甲烷的差异性分析

张双斌 ，赵树峰 ，郭红玉 ，简 阔

（1.晋城职业技术学院 矿业工程系, 山西 晋城 048026；2.河南理工大学 能源科学与工程学院, 河南 焦作 454000；3.太原科技大学 能源与材料工程学院, 山西 晋城 048011）

0 引 言

我国煤炭产量巨大，2021 年我国原煤产量41.3亿t，相比上年增长5.7%。煤炭用作燃料时，产生的污染物是长期影响大气环境质量的重要来源，同时也是未来中国减排控制的重点[1-2]。煤炭用作原料时，会造成产能过剩，污染排放严重[3-5]。洁净煤技术是当前国际上解决燃煤环境问题的主导技术之一，对提高煤炭开发利用效率、减轻环境污染具有重要意义。然而这些技术大都是利用物理、化学手段进行煤炭清洁利用，存在煤炭利用率低、环境污染大、能源消耗严重等问题[6-9]。生物技术具有环境友好、条件温和等优势。利用厌氧发酵技术能够将煤转化为生物甲烷[10-11]。

风化煤是地表或浅层煤经过长时间的气候、风化等作用形成的，具有含水量、挥发性高、机械强度、黏结性、着火点低等特点，不利于燃烧且污染环境[12]。郭红玉等提出利用煤层本源菌对风化煤进行转化利用，可实现风化煤原位生物甲烷化，有利于缓解温室效应和节约能源，同时发现，随着煤风化程度的增强，煤样芳构化程度不断降低，芳环被打开羟基、羧基等基团及脂肪结构不断解体，氧含量比例升高，越容易被微生物降解[13-14]。我国褐煤产量多，燃烧价值低，褐煤中丰富的有机质有利于生物甲烷的转化，褐煤已被证实在所有煤中生物产气量最大[15-16]。

国内外对煤转化为生物甲烷的研究很多，研究发现随着煤阶的不同，产气量存在明显差异。夏大平等研究了褐煤、肥煤、焦煤、贫煤的产气情况，发现甲烷产量与煤变质程度呈负相关[17]。李兴凤等[18]利用无烟煤进行生物产气，证实无烟煤虽然能够产气，但效果不如低变质程度煤。侯彪等[19]研究发现，不同煤阶煤产生物甲烷过程中，代谢功能存在明显差异，参与微生物代谢功能的长焰煤相对丰度显著高于其他试验组。参与辅酶、碳水化合物运输和代谢以及最大甲烷生产潜力之间存在良好的线性关系。苏现波等[20]对中国10 个地区的煤炭样品进行了微生物测试，发现所有地区的煤炭样本中都存在产氢产乙酸细菌。研究发现，古菌群落的多样性和丰度与煤的成熟度呈一定的负相关。然而，细菌群落中的物种丰度与煤的成熟度呈正相关，并且多样性呈现下降趋势。这表明，随着煤阶的上升，一些细菌群逐渐适应每个煤阶的环境，可以大量生长和繁殖。

前人对不同煤阶煤产甲烷都做了研究，但对风化煤与褐煤产气差异性内在机理还未做过深入对比研究。选取风化煤和褐煤进行生物产气试验，从不同方面探讨风化煤与褐煤产气差异性的内在原因，为今后风化煤与褐煤高效生物气化利用提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试验煤样选自内蒙古锡林郭勒的褐煤和山西晋城的风化煤。分别按照国家标准GB/T 30732—2014 和GB/T31391—2015 进行煤样工业分析和元素分析，测试结果见表1。试验前将2 种煤样分别粉碎至80～100 目（0.15～0.18 mm），并在80 ℃下干燥24 h，密封保存。

表1 褐煤和风化煤工业分析和元素分析Table 1 Proximate analysis and ultimate analysis of weathered coal and lignite

1.2 生物产气试验

按照文献[21]进行培养基配制，然后放入高温灭菌锅中灭菌（121 ℃，3 h）。灭菌后，按照培养基和驯化菌液3∶1 的比例配置产甲烷菌液，用N2置换瓶中空气3 min，用密封膜密封，并将其充分放置在35 ℃恒温培养箱中4～6 d。将粉碎的风化煤和褐煤20 g 分别放入250 mL 锥形瓶中，加入产甲烷菌液，充N23 min，搅拌均匀，放入35 ℃恒温培养箱中。产气时间为30 d。每组试验设置3 个平行样。用铝箔袋收集气体，使用校准注射器抽取气袋中的气体并计算气体量。甲烷定量分析使用气相色谱仪（Agilent 7890GC），参数为：TCD 检测器，5A 柱，进样器温度为50 ℃，检测器温度为100 ℃，热丝温度为120 ℃，测试气体为He，注样量为1 mL。

2 试验结果与分析

2.1 生物产气效果对比分析

将20 g 褐煤、风化煤和200 mL 菌液分别混合，进行产气试验。产气结果见表2，阶段性和累积性产气量如图1 所示。

图1 风化煤与褐煤阶段产气量和累计产气量Fig.1 Stage gas production and cumulative gas production

表2 风化煤与褐煤生物产气数据Table 2 Biogas production data of weathered coal and lignite

由表2 可知，褐煤的CH4产量最多为7.63 mL/g，而风化煤的CH4产量只有3.24 mL/g，褐煤CH4产量是风化煤的2.35 倍，说明褐煤转化生物甲烷的潜力大于风化煤。两种煤的阶段产气量、累计产气量如图1 所示。由图1a 可知，风化煤和褐煤阶段产气量整体呈先上升后下降的趋势，产气量在3～12 d 快速上升，到第12 天达到产气高峰，之后产气量快速下降，说明2 种煤中可利用的有机质得到了快速利用，到第24 天的时候迎来第二个产气小高峰，原因可能是一部分最初难降解的有机质已经被微生物逐渐转化利用，此时CH4的浓度达到最大，随后产气快速减少，直到第30 天产气结束。由图1b 可知，两种煤样的累计产气量差异较大，其中褐煤在第7 天的时候，累计产气量已经逐渐快速超越风化煤，说明褐煤在第7 天的降解效率已经超过风化煤。综上，褐煤的生物产气潜力远大于风化煤，在第12 天的时候达到产气高峰，两种煤样都存在二次产气高峰。

2.2 官能团变化对比分析

取生物产气前以及高峰期的褐煤和风化煤，干燥后筛分粒度至200 目以下，使用Nicolet 6700 傅里叶红外光谱仪对褐煤和风化煤进行官能团测试。在4 000～400 cm-1的波数范围内扫描32 次，光谱分辨率为8 cm-1。样品测试前先将ATR 附件置于红外光谱仪的光路中，扫描空气背景。褐煤和风化煤的红外光谱特征图如图2 所示。

图2 褐煤和风化煤产气前后红外光谱特征Fig.2 Infrared spectral characteristics of lignite and weathered coal gas production peak

根据文献[22]FTIR 吸收峰的归属可知，3 550～3 200 cm-1波段为酚、醇、羧酸、过氧化物、水中的OH 的伸缩震动，酚是芳香烃芳环上的氢被羟基（—OH）取代后所生成的一类化合物，而羟基取代脂肪烃、脂环烃或芳香烃侧链中的氢原子最终形成化合物醇[23]。羧酸是由烃基与羧基相连构成的有机酸，而风化煤在该波段的吸收峰相比于褐煤更加明显，这是因为在产气高峰期褐煤相比于风化煤生物降解效果更加明显，煤大分子结构受到破坏，酚、醇、羧酸、过氧化物等基团进一步降解转化，导致该波段吸收峰减弱。1 605～1 525 cm-1为芳香碳碳双键的伸缩振动，褐煤和风化煤都表现出了明显的吸收峰，同样，褐煤的吸收峰相对于风化煤较小，这是因为在微生物作用下，煤的大分子结构发生变化，芳香类物质部分被转化为小分子量物质，而褐煤的降解效果明显，导致吸收峰出现明显减弱。1 390～1 020 cm-1为硅－氧－硅或硅－氧－碳的伸缩振动，在生物降解过程中，煤中碳、氧原子会发生变化，参与甲烷的生成，而褐煤在该范围内的吸收峰强度小于风化煤，表明褐煤在生物降解过程中有更多的C、O 原子参与甲烷生成。综上，在褐煤的生物气生产过程中，煤中的脂肪结构、羟基、氨基等各种基团完全脱落，芳香类物质部分转化为其他分子量较小的物质，相应的吸收峰较弱。风化煤虽然在一定程度上得到降解，但明显弱于褐煤。

2.3 表面元素赋存状态变化

采用XPS peak4.1 软件进行数据分析，并采用Gaussian-Lorentzian（20%～80%）复合函数对有机碳C1s 的XPS 图谱进行拟合，其中，C—C、C—H 键结合能为285.0±0.2 eV，C—O 键结合能为286.3±0.2 eV，C=O 键结合能为287.5±0.2 eV，O—C=O 键结合能为289.0±0.2 eV[24]（图3）。不同赋存形态有机碳的相对含量见表3。

图3 生物产气高峰期褐煤与风化煤C（1s）的XPS 拟合谱图Fig.3 XPS fitting spectra of lignite and weathered coal C (1s)during biogas production peak

表3 不同赋存形态有机碳的相对含量Table 3 Relative contents of organic carbon in different forms

由图3 和表3 可知，对比褐煤和风化煤表面在产气高峰期有机碳元素的不同赋存状态，可以发现芳香单元及其取代的烷烃（C—C、C—H）在煤样品表面占据绝对优势。其中褐煤在生物产气高峰期的C—C、C—H 的相对含量远低于风化煤，相比于风化煤减少了14.05%。而酚碳或醚碳（C—O）、羰基碳（C=O）、羧基碳（COO—）在褐煤中的相对含量要大于风化煤，分别增加了108.44%、140.91%和113.35%，这是因为褐煤相比于风化煤更易降解，导致在生物降解的过程中，煤大分子结构中原有的侧链及官能团中的取代烷烃易被生物酶分解，H2O 及O2中的O 原子相对于煤结构中O 原子易获取，微生物会固定并利用煤本身外的O 原子，导致煤结构中原有的侧链、含氧官能团数量增加，从而使含氧有机碳（C—O、C=O、O—C=O）的含量增加。综上，结合样品元素赋存状态变化发现，褐煤和风化煤在微生物降解的过程中，酚碳或醚碳（C—O）会被氧化为羰基碳（C=O）、羧基碳（O—C=O），最终形成小分子有机酸类等物，使得微生物能够利用小分子及酸类物质进行生物产气，而褐煤在生物降解过程中的C—O、C=O 氧化最为明显，故而生物产气较多。

2.4 产气高峰期表面形貌变化

将产气高峰期的风化煤和褐煤各取数块，放入干燥箱中干燥1 h，得到观察用煤样。试验采用JFC-1 600离子溅射仪和JSEM-6 390/LV 扫描电子显微镜分别对煤样进行喷金处理和表面形貌观测，观测结果见图4。由图4a、4b、4c 可知，风化煤结构呈固态块状，表面光滑且平整，只有少数区域出现孔隙和裂缝，而图4d、4e、4f 褐煤表面变的粗糙，同时出现较多裂隙和孔隙，尤其是图4f，整个观察面都布满了孔裂隙和一些堆积成的球状颗粒物，同时具有较明显的孔洞。这是因为，在微生物作用下，褐煤表面被侵蚀，造成了一些孔隙的增加和块状物的分解，这就使得有机质能够从这些孔隙中析出，有利于微生物进一步利用产气。由此可以看出，褐煤的降解效果最为明显，产气较多，而风化煤中有机质少，微生物对其侵蚀较弱，因而产气较少。

图4 产气高峰期褐煤与风化煤扫描电镜图Fig.4 SEM images of lignite and weathered coal at the peak of gas production

2.5 菌群多样性、种类及丰度变化

使用快速DNA 旋转提取试剂盒（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA）提取发酵液中细菌与古菌总基因组DNA 样品，并在进一步分析前储存在-20 °C。PCR 扩增选择细菌16S rRNA V3-V4 区域特异性引物和古菌16S rRNA V8-V9 区域特异性引物。PCR 使用NEB Q5 DNA 聚合酶，用2%甘油凝胶显示扩增结果。切割目标片段后，使用Axygen 凝胶回收试剂盒回收目标片段。

扩增产物经Agencurt AMPure Beads（Beckman Coulter，Indianapolis, IN）纯化，PCR 产物通过Pico-Green dsDNA 分析试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）在微板读取器（BioTek，FLx800）上进行定量。定量完成后，根据每个样品所需的数据量进行混合，然后将样品交付给上海派森诺有限公司建库，并在MiSeq 机器上使用MiSeq Agent Kit V3（600 个循环）2×300 bp 双端测序。

利用QIIME 的OTU 表计算OTU 水平的alpha 多样性指数。微生物功能通过PICRUSt 软件（通过重构未观察状态进行群落系统发育调查）进行预测，基于KEGG 甲烷代谢通路(Map: 00010, Map:00680)，挑选出预测丰度大于100 的相关糖酵解，乙醛酸循环途径和电子转移途径以及三羧酸循环的代谢基因表达进行评估。

由表4 可知，对于不同的菌群群落（细菌、古菌），风化煤与褐煤的Chao1，Species 和Shannon 指数差异较小；而两者相比，细菌群落的Chao1、Species 和Shannon 指数则远大于古菌群落。Shannon 指数反映了菌群的多样性。值越高，菌群的多样性越高[25]。由此可以看出，细菌和古菌之间具有较大的多样性和丰度差异，细菌往往种类丰富且含量较多，古菌数量较少且比较单一。

表4 不同底物下菌株的多样性指数分析Table 4 Analysis of diversity index of strains under different substrates

由图5a、5b 可知，褐煤和风化煤产气高峰期所含有的古菌、细菌差异性不大。在细菌群落中，所共有的细菌数为133 个，其中褐煤中所特有的细菌数最少，占总数的44.09%。说明褐煤发酵时菌群单一，但结合产气效果来看，褐煤产气较好，原因可能是褐煤中某一菌属占优势，从而多样性较小，主要细菌对褐煤的降解作用强，以至于后期产甲烷较多。同样，在古菌多样性分析中，风化煤古菌多样性较大，但产气差，原因可能是主要产甲烷古菌并不占据主导优势，导致生物甲烷产出较少，而褐煤中主要产甲烷古菌占比较大，甲烷合成反而较多，这与后面的古菌种类及丰度相对应。

图5 菌群多样性分析古菌韦恩图细菌韦恩图Fig.5 Analysis of bacterial diversity Archaeal Venn diagram Bacterial Venn diagram

褐煤与风化煤产气高峰期细菌和古菌种类及其丰度如图6 所示。由图6a 可知，褐煤与风化煤在产气高峰期细菌菌群组成以Macellibacteroides、Lysinibacillus、Sphaerochaeta、Sulfuricurvum和Geobacter为主。风化煤中Macellibacteroides属在细菌中占比最大为29.05%，该菌属使用纤维二糖、葡萄糖、乳糖、等作为电子供体，代谢产物是乳酸、乙酸、丁酸和异丁酸[26]。其次是Sulfuricurvum，占比20.44%，该菌属在微需氧条件下，氧也充当电子受体，不依赖糖、有机酸或碳氢化合物作为碳和能源，该菌属对煤降解产酸没有积极作用[27]，但在风化煤中占比较大，由此可证明，风化煤中有机质降解功能微生物占比较少。而褐煤中占比较大的Lysinibacillus属（43.44%）、Macellibacteroides属（15.88%）、Sphaerochaeta属（8.73%）都是利用有机质产酸的菌属，Lysinibacillus属为化能异养型微生物，每个细胞产一个芽孢，能适应许多不良环境，具有发酵或呼吸代谢类型。发酵代谢产物是丙酸、丁酸和己酸[28]。因此对煤中有机质的降解利用起到积极作用，能为后续产甲烷菌提供原料。综上，褐煤中有机质降解产酸的菌属占比较多，主要功能菌群占比高达68.05%，而风化煤中功能菌群较少（42.72%），不利于微生物对有机质的降解产酸，结合产气情况来看甲烷产量低于褐煤。

图6 褐煤与风化煤产气高峰期菌群组成及丰度Fig.6 Composition and abundance of bacteria in lignite and weathered coal gas production peak

由图6b 可知，褐煤与风化煤产气高峰期古菌组成主要以甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷丝菌属（Methanothrix）组成。甲烷丝菌属（Methanothrix）能量代谢表现分解乙酸为CH4和CO2不利用H2和CO2、甲酸盐、甲基胺和甲醇[29]，在风化煤和褐煤中占比较少。甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）在风化煤中占比（59.54%）大于褐煤（48.49%），该古菌可以将甲基胺或甲醇转化 为CH4、CO2和NH3。其 他 的 代 谢 底 物 还有H2+CO2或乙酸[30]。而甲烷杆菌属（Methanobacterium）在风化煤中的占比只有4.69%，在褐煤中的占比高达41.50%。甲烷杆菌属（Methanobacterium）能量代谢来源于还原CO2为CH4；电子供体只有H2，不能代谢甲基胺和乙酸[31]。同样，风化煤中功能产甲烷微生物占比只有65.03%，而在褐煤中功能微生物占比高达89.99%，由此说明，褐煤更有利于被微生物利用产生物甲烷，同时根据功能微生物的代谢产物可以发现，风化煤的甲烷代谢类型为甲基类营养性，而褐煤的甲烷代谢类型为氢营养型。

2.6 产气高峰期代谢通路统计

选取褐煤与风化煤在细菌降解时的前体代谢物和能量产生含有的代谢途径进行对比分析，具体结果如图7 所示。

图7 风化煤与褐煤产气高峰期代谢通路统计Fig.7 Statistics of metabolic pathways during the peak gas production of weathered coal and lignite

由图7 可知，褐煤代谢通路中糖酵解途径(glycolytic pathway)、乙醛酸循环（Glyoxylate cycle）途径、电子转移途径（Electron Transfer）、三羧酸循环（TCA,tricarboxylic acid cycle）的相对丰度都远大于风化煤。糖酵解途径(glycolytic pathway)，又称EMP 途径，是将葡萄糖和糖原分解为丙酮酸，并生成ATP 的一系列反应[32]。乙醛酸循环（Glyoxylate cycle）中的微生物使用乙酸作为碳源，并作为能量利用的代谢途径[33]。功能通路电子转移（Electron Transfer）在于任何氧化还原反应中，相对丰度越大，反应速率越快，氧化（还原性）越强[34]。三羧酸循环（TCA,tricarboxylic acid cycle），该循环消耗乙酸（以乙酰辅酶A 的形式）和水，将NAD+还原为NADH，释放二氧化碳。这两个密切相关的途径的最终结果是营养物质的氧化以ATP 的形式产生可用的化学能[33]。综上，褐煤相对于风化煤在生物降解的过程中，微生物能够更好地利用乙酸作为碳源、葡萄糖和糖原能够被有效降解为丙酮酸，氧化（还原性）强，并产生供生化反应所需的ATP，利于生化反应的进行，为后续的生物甲烷转化提供能量代谢基础。

3 结 论

1）褐煤的生物产气潜力（7.63 mL/g）大于风化煤（3.24 mL/g），在第12 天的时候达到产气高峰，两种煤样都存在二次产气高峰。

2）在褐煤生物产气过程中，煤中的脂肪结构、羟基、氨基等各种基团会脱落，一些芳香物质会转化为其他分子量较小的物质，对应的吸收峰表现较弱，而风化煤虽然也得到了一定降解，但明显弱于褐煤。同样，褐煤中酚碳或醚碳（C—O）相较于风化煤氧化明显。生物产气高峰期风化煤结构呈固态块状，表面光滑且平整，只有少数区域出现孔隙和裂缝，而褐煤表面变的粗糙，出现较多裂隙和孔隙。

3）褐煤的菌群种类较风化煤单一，且优势菌群丰度大（细菌：68.05%，古菌：59.54%）。风化煤的甲烷代谢类型为甲基类营养性，而褐煤的甲烷代谢类型为氢营养型。褐煤相对于风化煤产气过程中微生物能够更好的将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸，氧化（还原性）强，并产生供生化反应所需的ATP。