经典藏药如意珍宝片多次给药的药代动力学研究

侯红平 王彩霞 彭 博 李 冰 刘荣霞 陈腾飞 李 峰 车向宜 宋 玲 高云航 杨 庆 罗 倩 叶祖光 张广平

(1 中国中医科学院中药研究所,北京,100029; 2 烟台赛普特检测服务有限公司,烟台,264005;3 山东烟台大学,烟台,264005; 4 甘肃奇正藏药有限公司,北京,100102)

根植于高原的藏族医药(以下简称为藏医药)学是世界传统医学宝库的重要组成部分,是世界上最古老的传统医药体系之一,源于西藏,关于其文字记载始于1 300多年前。现代藏药应用的地域除西藏自治区外,还包括青海、内蒙古、四川、云南等地所属的一些自治区和县。传统藏医药在脑卒中、阿尔茨海默病、癫痫、血管神经性头痛等疾病中构建了对中枢神经系统疾病的整体认识及辨证用药规律[1-3],在现代藏医临床诊疗中具有较高的使用频率。采用现代医学技术方法和手段,解析经典藏医药的特色和优势,不仅能够展现其在现代医学中的临床价值,而且补充现代医疗的不足。

珍宝类复方是藏医家以名贵、珍稀藏药材进行调配组合的经典且独特的配方形式。其中,如意珍宝片处方初见于13世纪藏医药学家仁青坚赞所著的《秘诀珍珠串》,收录于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》,也是藏医中名贵的珍宝药物之一,由珍珠母、红花、人工麝香、决明子、肉豆蔻、诃子、余甘子、沉香等30味药材组成;具有清热醒脑、舒经通络、活血化瘀、促进血液循环的作用,主要用于治疗藏医中的白脉病,同时能够改善瘫痪、口眼斜、通风、关节不利等症状[4-5],广泛应用于临床。

目前,基于藏医理论的研究基础较为薄弱,未形成精准临床定位并形成合理用药规范。本研究以如意珍宝片范例,采用现代质谱技术和高效液相色谱技术的联合分析,探讨如意珍宝片多次给药的药代动力学特征和组织分布,寻找其药物代谢的规律和特点,为藏医药的精准定位和临床的合理用药提供依据,对藏医药的发展具有重要的作用。

1 材料

1.1 动物 斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,体质量150～170 g,5～6周龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,SCXK(京)2016-0011。饲养于中国中医科学院中药研究所实验动物屏障环境(SPF级)中,SYXK(京)2019-0003。饲养条件：屏障环境温度20～24 ℃,相对湿度45%～65%,12 h/12 h光照与黑暗交替进行。所有实验操作均获得中药研究所动物伦理委员会的许可(伦理审批号：2020B134)。

1.2 药物 如意珍宝片(奇正藏药股份有限公司,批号：2004007)。

1.3 试剂与仪器 沉香四醇(成都普思生物科技股份有限公司,批号：PU0295-0025,纯度99.7%),胡椒碱(大连美仑生物技术有限公司,批号：A0528AS,纯度99.0%),异甘草素(上海麦克林生化科技有限公司,批号：C10987045,纯度99.2%),阿魏酸(上海麦克林生化科技有限公司,批号：C11347527,纯度99.2%),伏立诺他(上海麦克林生化科技有限公司,批号：C11120592,纯度98.7%)等。超高效液相色谱系统(Waters公司,美国,型号：ACQUITY UPLC H-CLASS),质谱系统(SCIEX公司,美国,型号：6500+),分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司,瑞士,型号：METTLER TOLEDO XPE205),离心机(艾本德股份公司,德国,型号：5427R),涡旋混合仪(IKA公司,德国,型号：VORTEX2)。

2 方法

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18,2.1×100 mm I.D.,1.7 μm粒径。预柱：ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-column,130 Å,1.7 μm,2.1 mm×5 mm。流动相A(Mobile PhaseA：MPA)：5 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸)。流动相B(Mobile PhaseB：MPB)：甲醇。柱温箱温度(Column Temperature)：40 ℃。流速(Flow Rate)：0.300 mL/min。自动进样器温度：4 ℃。进样体积(Injection Volume)：5.00 μL[6]。

2.1.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子化(Electrospray Ionization,ESI)。离子化模式(Ionization Mode)：正/负(Positive/Negative)离子模式。监测模式(Mode)：多反应监测(MRM)。电喷雾电压(Ion Spray Voltage)：5 500 V/-4 500 V。离子喷雾温度(Ion Spray Temp)：450 ℃。气帘气种类(Curtain Gas Type)：氮气设置(Nitrogen Setting),35.0 psi。雾化气种类(Nebulizing Gas,Gas1)：Nitrogen Setting,50.0 psi。辅助气种类(Auxiliary Gas,Gas 2)：Nitrogen Setting,50.0 psi。数据采集时间(Acquisition Time)：10.0 min[6]。

表1 不同分析物的分析条件

2.2 标准曲线制备 取空白大鼠血浆45.0 μL于2.0 mL离心管中,加入标准系列溶液或质控溶液5.00 μL,涡旋10 s混合均匀,使血浆中的胡椒碱和异甘草素浓度分别相当于0.100、0.500、1.00、4.00、10.0、40.0、100、200 ng/mL,沉香四醇、阿魏酸浓度相当于0.500、2.50、5.00、20.0、50.0、200、500、1 000 ng/mL或异甘草素、胡椒碱浓度相当于0.300、1.50、15.0、150 ng/mL;沉香四醇、阿魏酸浓度相当于1.50、7.50、75.0、750 ng/mL,按上述操作,经高效液相色谱-串联质谱(High Performance Liquid Chromatography-tandem mass Spectrometry,HPLC-MS/MS)分析。

2.3 线性关系考察 按照上述方法制备校正标样。

2.4 精密度试验 按照上述方法配制高浓度质控样品(High-concentration Quality Control,HQC)、中浓度质控样品(Middle-concentration Quality Control,MQC)、低浓度质控样品(Low-concentration Quality Control,LQC)及定量下限(Lower Limit of Quantitative,LLOQ)4个浓度的血浆样品,进行准确度和精密度实验(n=6)。批间精密度实验时,3 d内进行上述实验3批次,计算n=18的精密度。

2.5 稳定性试验 考察大鼠血浆样品室温放置6 h、样品经处理后自动进样器放置24 h、3次冷冻-解冻循环(-80 ℃,12 h)、在-80 ℃下4个月后待测物的稳定性以及对照品储备液2～8 ℃ 2个月内稳定性。

2.6 血浆样品处理 取大鼠血浆样品50.0 μL于2.0 mL离心管中,加入含有内标的甲醇溶液(80.0 ng/mL)150 μL,涡旋1 min,离心15 min(12 700 r/min,4 ℃,离心半径：20 cm),取上清100 μL于2.0 mL离心管中,加水50.0 μL稀释,涡旋1 min,取上清100 μL于进样小瓶中,经LC-MS/MS分析。

2.7 给药方法与血样采集 SD大鼠12只,雌雄各半,按体质量随机分层方法,分为2组,对照组和观察组(最大给药剂量,6.00 g/kg),连续给药7 d,在最后一次给药前0 min及给药开始后0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、24、48 h眼眶采血,肝素抗凝,4 ℃,10 000 r/mim(离心半径：20 cm)离心2 min,分装血浆,-80 ℃冻存。

2.8 数据处理及分析 数据-图谱积分方法：分析物和内标的色谱图采集由软件Analyst 1.6.3完成,色谱峰积分由分析软件MultiQuant 3.0.3(AB Sciex)进行处理,在优化积分参数后,对目标色谱峰自动积分,不允许对色谱峰进行单独积分或手动积分。分析物浓度计算：由分析软件MultiQuant 3.0.3完成积分后,采用加权(W=1/x2)最小二乘法以血浆中分析物浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归,所得的回归方程(Y=a+bX)即为标准曲线。根据分析批的标准曲线计算大鼠血浆中分析物的浓度,单位为ng/mL。应用Phoenix WinNonlin(版本8.1.0.3530)的非房室模型模块进行药代参数计算[7]。统计分析基于主要药动学参数(Cmax和AUC0-t)对数转换后服从正态分布假设,对转换后的参数采用LEVENE检验进行方差齐性检验,当方差齐性(P>0.05),性别差异采用Student-t检验,剂量差异采用单因素方差分析,当方差不齐性(P≤0.05),性别差异采用Mann-WhitneyU检验(M-W法),剂量差异采用Kruskal-WallisH秩和检验进行统计分析,对于不服从正态分布的其他药动学参数,性别差异采用Mann-WhitneyU检验(M-W法),剂量差异采用Kruskal-WallisH秩和检验进行统计分析。

3 结果

3.1 方法学评价

3.1.1 线性关系考察 胡椒碱和异甘草素在0.100～200 ng/mL范围内线性关系良好(R2≥0.997),沉香四醇在0.500～1 000 ng/mL范围内线性关系良好(R2≥0.999),阿魏酸在2.50～1 000 ng/mL范围内线性关系良好(R2≥0.998)。至少75%的校正标样(含最少6个有效浓度)的回算浓度在标示值的±13%以内,定量下限在±4%以内,方法灵敏度高、线性范围宽,结果符合生物分析相关要求[6]。

3.1.2 精密度 分析结果表明方法准确度高、精密度好,结果符合生物分析相关要求[6]。

3.1.3 稳定性 样品室温6 h内稳定,样品经处理后在自动进样器放置24 h稳定,样品3次冻融循环稳定,样品-80 ℃ 4个月内稳定,对照品储备液2～8 ℃ 2个月内稳定。

3.2 药代动力学

3.2.1 4种成分的药时曲线 大鼠连续7天灌胃给予如意珍宝片6.00 g/kg的体内血浆中沉香四醇、异甘草素、胡椒碱、阿魏酸的平均药时曲线。见图1。

图1 4种成分的药时曲线

3.2.2 性别导致体内药代动力学参数的差异比较 经统计分析,结果表明性别差异不会对沉香四醇、异甘草素和胡椒碱的药动学参数产生影响(P>0.05)。而性别差异会对阿魏酸的Cmax、AUC0-t产生影响(P<0.01或P<0.001),不会对Tmax产生影响(P>0.05)。见表2。

表2 性别导致体内药代动力学参数的差异比较

4 讨论

如意珍宝丸,又名“桑培奴布日布”,是藏医名贵珍宝药物之一,由珍珠母、沉香、金礞石、红花等30味藏药材组成,具有清热、醒脑开窍、舒筋活络等功效,主要用于治疗温热病、陈旧热证、白脉病、偏瘫、口眼斜等病症[8-10]。现代药理研究表明,如意珍宝片能显著提高血管性痴呆模型大鼠脑内单胺类神经递质水平[11],可显著改变硝酸甘油致偏头痛模型大鼠脑电图的异常频段波,对偏头痛的治疗效果较好[12-13],同时可明显降低急性血瘀模型大鼠血液中切变率黏度值、血浆黏度值、红细胞聚集指数等[14]。

本研究根据如意珍宝片的药材组成及前期进行的入血成分研究,选取来自于如意珍宝片的药材中可能的活性成分[15-16],选取了沉香中的沉香四醇(C17H18O6),荜茇中的胡椒碱(C17H19NO3)、降香中的异甘草素(C15H12O4)和甘草膏中的阿魏酸(C10H10O4)作为目标化合物,建立了4种化合物在血浆和组织中的含量检测方法。

大鼠给予7 d连续灌胃如意珍宝片后,血浆中沉香四醇达峰时间大部分在1～8 h之间。阿魏酸血药浓度在给药间隔时间内在体内血药浓度呈波动状态,推测主要的原因是食源性影响,大鼠在给药同时食用可能含有阿魏酸的谷物饲料,导致阿魏酸在体内血药浓度呈波动状态[17-20]。经t检验和秩和检验分析,沉香四醇、异甘草素和胡椒碱在大鼠体内主要药动学参数差异无统计学意义(P>0.05),阿魏酸在大鼠体内主要药动学参数(Cmax、AUC0-t)差异有统计学意义(P<0.01)。

本研究通过前期方法学的建立和验证,对经典藏药如意珍宝片的多次药代动力学特征进行了解析,为藏药药代动力学方法的探索和建立提供了示范,不但对临床应用有一定的指导作用,同时加快对藏药理论和药物的研究历程,具有重要的价值和意义。

利益冲突声明：无。