包膜蛋白在痘苗病毒形态发生过程中作用的研究进展

王建，胡紫微 综述，郑柏松 审校

吉林大学第一医院艾滋病与病毒研究所，吉林 长春 130000

正痘病毒属（Orthopoxvirus）包括猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）、痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）、天花病毒（variola virus，VARV）、牛痘病毒（cowpox virus，CPXV）等17 个同属病毒［1］。以VACV 为代表的正痘病毒是一种大型线性双链DNA 病毒，呈椭圆形或砖形，外附脂蛋白外膜。VACV 基因组大小约为200 000 bp，编码约209 个基因产物［2］。病毒基因组包含1个高度保守的中心编码序列（central coding region sequence，CRS）区域，可编码病毒形态发生各时期的关键蛋白［3］。CRS 两侧可变区含有反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITRs），包含决定宿主范围和毒力的基因［3］。

VACV的生命周期起始于病毒表面的膜蛋白与细胞表面附着，随后进行膜融合。成熟病毒粒子（intracellular mature virus，IMV）进入细胞后，在病毒工厂进行复制、转录和翻译，并开始组装［4］。多数组装完整的IMV 在细胞裂解时被释放，也可通过微管移动至内体或反式高尔基体网络结构（transGolgi network，TGN）中，经双层膜包裹，成为细胞内囊膜病毒粒子（intracellular enveloped virus，IEV）；IEV 在微管的介导下到达细胞膜，与细胞膜融合后附着于质膜上，称为细胞相关囊膜病毒粒子（cell-associated enveloped virus，CEV）；CEV 在肌动蛋白尾的作用下脱离细胞并在细胞间传播，称为细胞外囊膜病毒（extracellular enveloped virus，EEV）［5-6］。IMV和EEV是VACV两种主要感染形式，但EEV 和CEV 最外层附加膜中含有约7种不同于IMV的蛋白［7］。A33R、A34R、A56R、B5R和F13L 存在于IEV、CEV 和EEV 中，而A36R 和F12L仅存在于IEV 中［4］。近年，对VACV 的基因组序列组成、病毒蛋白结构与功能、病毒蛋白间相互作用和形态发生过程等的研究已逐步深入，本文就包膜蛋白在VACV 形态发生过程中作用的研究进展作一综述，以期为进一步研究VACV 的致病机理，有效预防VACV感染及疫苗研制提供理论依据。

1 VACV包膜蛋白在膜附着和膜融合中的作用

研究表明，VACV 对细胞的侵入过程分为膜附着和膜融合两个阶段，包膜蛋白A27L 和A28L 在入侵过程中发挥重要作用。VAZQUEZ 等［8］通过A27L蛋白基因表达缺陷的重组病毒体试验发现，在病毒附着及后续的膜融合中，A27L 蛋白均发挥了重要作用。A27L 蛋白是由110 个氨基酸组成的膜融合蛋白，由N-末端表面肝素结合功能域（heparin-binding sequence，HBS）、二硫键连接结构域（disulfide-linked domain，DLD）、C-末端亮氨酸拉链域（leucine zipper domain，LZD）、柔性间隔区和螺旋卷曲螺旋结构域（α-helical coiled-coil domain，CCD）等5 个功能域构成［6，9］。其中，N-末端的HBS（21～32位残基）呈KKPE片段折叠样结构，可通过糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）与细胞表面的肝素分子发生特异性结合，促进病毒附着于细胞膜上［10-11］，而A27L 蛋白C-末端的LZD（85～110位残基）通过与A17L蛋白N-末端的F1（32～36 位残基）和F2（20～29 位残基）位点发生特异性相互作用，锚定在IMV 膜表面［12-13］。因此，A27L 蛋白的缺失或点突变会减少病毒对细胞的侵染，使感染突变株病毒的单层细胞呈小斑块表型，EEV产生减少［14］。

另外，A28L 还介导了病毒与细胞的融合。SENKEVICH 等［15］发现，A28L 缺陷型的重组病毒体仅可进行单轮复制，产生的缺陷病毒具有膜融合相关缺陷，不能再次进入细胞进行生产性感染。含146 个氨基酸的A28L蛋白在病毒复制周期后期表达，其N-末端将该蛋白锚定在IMV 的膜表面，其他部分则暴露在病毒颗粒表面［16］。相关研究表明，在IMV 膜的胞质内，A28L 蛋白通过正痘病毒特异性的氧化还原途径形成2个分子内二硫键［16］。

2 VACV包膜蛋白在病毒粒子组装中的作用

包膜蛋白A17L 和A13L 参与了病毒粒子的组装过程，并发挥重要作用。WOLFFE 等［17］通过A17L 缺陷型的重组病毒体证明，A17L 蛋白缺失会导致病毒粒子早期形态发生阻断，此时，电镜下仅能观察到致密的电子结构，未观察到新月形膜结构。在病毒组装的早期，含203 个氨基酸的A17L 前体蛋白利用其N-末端结构将支架蛋白D13L 锚定在新月体膜上［18］。A17L N-末端和C-末端的AGX共识基序经I7L 蛋白酶酶切，释放D13L 蛋白，使未成熟病毒粒子（immature virus，IV）向IMV转变［19］。而A17L蛋白C-末端受其他蛋白酶切割，可在F10L 激酶的作用下发生磷酸化反应［20］。另外，A17L 单体通过与Cys178形成的分子间二硫键连接为同源二聚体，并与A27L 和A14L 蛋白共同形成稳定的复合物，在IMV 的双层膜包裹中发挥重要作用［21］。

感染后期表达A13L 蛋白是病毒粒子组装不可缺的过程。研究发现，A13L 缺失会导致病毒形态发生停滞在IV 向IMV 转变的过渡期，影响病毒粒子的生命周期进程［22］。A13L 蛋白是由70 个氨基酸组成的IMV 表面Ⅱ型膜蛋白，其N-末端（1～20 位残基）包含1 个肉豆蔻酰化基序，有利于该蛋白以共翻译的方式插入至内质网或内质网高尔基中间室，并在膜包裹过程中成为IMV表面的膜组分［22］。而其C-末端特殊的拓扑结构使该蛋白从IMV 膜内部延伸至表面，成为第1个出现在IMV内外膜表面的蛋白质［23］。

3 VACV包膜蛋白在IMV胞内运动中的作用

IMV 在病毒工厂组装完成后，移动至TGN，包裹双层膜成为IEV，再移动至细胞膜附近进行出膜。这些胞内运动均依赖于细胞内的微管，而组成微管的驱动蛋白-1 又与A36R 包膜蛋白存在密切的相互作用。

A36R 蛋白是IEV 外表面的一种特异性非糖基化跨膜蛋白，含有2个以色氨酸为基础的驱动蛋白-1结合基序，即WD（97～98位残基）和WE（64～65位残基），是A36R蛋白募集驱动蛋白-1所必需的基序［24］。驱动蛋白-1 由2 条重链（kinesin heavy chain，KHC）和2 条轻链（kinesin light chain，KLC）组成。A36R 蛋白的WD／WE 基序与驱动蛋白-1 亚型KLC1 C-末端的四肽重复序列（tetratricopeptide repeat region of the kinesin light chain，KLC-TPR）相互作用，并优先结合KLC1［24］。

HERRERO-MARTINEZ 等［25］研究发现，当A36R蛋白缺失时，IEV仍可沿微管运动至细胞外形成CEV，并可受微管解聚药物的可逆性抑制，推测还有其他蛋白作用于微管并辅助IEV 的运动。另有研究证明，A27L蛋白参与了微管依赖的IEV胞内运动，协助IMV 从病毒工厂顺利转运至TGN，并在IMV 双层膜包裹中发挥重要作用，抑制A27L 的表达，导致IMV的转运受阻［26］。

4 VACV包膜蛋白在EEV细胞间传播中的作用

IEV 从细胞融出转变为CEV 并附着于细胞外表面，其下方质膜处通过形成肌动蛋白尾协助其在细胞间传播。据报道，有5种蛋白（A33R、A34R、A36R、B5R 和F13L）与肌动蛋白尾的形成有关，其中仅有A36R 参与了肌动蛋白尾的形成，其他4 种是IEV 形成所必需的蛋白。

A33R、A34R 和B5R 蛋白位于IEV 的双层膜上，当IEV 脂蛋白膜与细胞膜融合时，这些蛋白分布在CEV 外膜和细胞质膜上，有助于CEV 附着在细胞表面［27］。WARD 等［28］研究发现，A36R 蛋白融入IEV 外膜依赖于A33R 蛋白，通过酵母双杂交系统和A36R缺失突变的重组痘苗病毒株进一步研究发现，A36R和A33R 蛋白的非共价连接实际上是A36R 蛋白99～111位氨基酸残基与A33R蛋白的胞质尾发生的强相互作用。

研究发现，IEV与胞膜融合时，A36R蛋白被极化并发生磷酸化［29］。A36R蛋白的Tyr112和Tyr132发生磷酸化后产生了与Nck 和生长因子受体结合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2，Grb2）SH2 结构域结合的位点［30-32］。磷酸化后的Tyr112可招募WIP、N-WASP和Nck组成的复合物，并激活RSV调节肌动蛋白相关蛋白2／3（RSV modulates actin-related protein 2／3，ARP2／3）复合物诱导肌动蛋白成核［31-32］。而磷酸化后的Tyr132负责招募Grb2，可稳定WIP、NWASP和Nck组成的复合物，有助于肌动蛋白尾的合成［31-33］。Grb2 在该过程中的作用不可缺，当Grb2 缺失时，每个细胞的肌动蛋白尾数量平均减少2.6倍［34］。

5 VACV包膜蛋白在疫苗研究中的应用

MPXV 感染引发的疾病称为猴痘，其主要症状为发热、淋巴结肿大、肌肉痛、头痛等。猴痘暴发的强度和数量仍在持续上升，严重威胁人类健康［35-36］，引发了全球对正痘病毒的关注。因此，有必要开发和完善VACV 的防控政策［37］。天花是唯一被根除的人类疾病，这也为使用疫苗消灭VACV 提供了可能性［38］。

保护性抗体主要针对IMV和EEV两种感染形式的VACV表面蛋白，因此，可通过这些病毒形式的组合蛋白更好地激发完全保护性免疫［39］。目前，VACV疫苗的研究多集中在具有免疫原性的蛋白L1R、A27L、B5R 和A33R［40］。多项研究表明，用VACV 的L1R和A33R基因制备的DNA 疫苗及B5R 蛋白进行免疫，可保护小鼠免受致命的VACV攻击［41-42］。RUDRARAJU等［43］研究发现，用编码A27L的重组腺病毒进行单次肌内注射，可保护小鼠免受VACV 的致命鼻内攻击，接种疫苗后10 周，感染后发病率显著下降，免疫原性和保护效力至少可持续35 周。研究发现，一种无病毒编码VACV A27L 蛋白的DNA 疫苗制剂可刺激产生A27L 特异性IFNγ，并于接种7 d 后提高体液免疫力［44-45］。

6 小结与展望

包膜蛋白在VACV 形态发生的各时期均发挥了重要作用。A27L 蛋白利用与细胞表面的肝素分子结合促进病毒对细胞的附着，并与A17L蛋白N-末端F1、F2 位点相互作用，锚定在病毒膜上。A28L 蛋白参与VACV 与细胞膜的融合过程，A28L 缺失的病毒突变体不能进入细胞开始感染过程。除了可帮助锚定外，A17L 蛋白可将A26L、A27L 和D13L 蛋白锚定在病毒膜上，并帮助D13L 蛋白实现稳定膜弯曲的作用。A36R 蛋白在病毒体的细胞内和细胞外运动中均起重要作用。A36R 蛋白与驱动蛋白-1 相互作用，参与微管介导的胞内运输。而A36R 蛋白Tyr112和Tyr132磷酸化后，与Nck、WIP 和N-WASP 组成的三元复合物及Grb2 结合，诱导肌动蛋白成核，并促进肌动蛋白的形成。在未来的研究中，将对这几种蛋白进行深入研究，为相应抗病毒药物在病毒形态发生各时期作用的研究提供理论基础。