基于网络药理学和分子对接技术探讨淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的作用机制

徐艳红,金 鑫,郭一沙,刘 睿

(1. 天津中医药大学中药制药工程学院,天津 301617;2. 天津中医药大学现代中医药海河实验室,天津 301617;3. 武警后勤学院,天津 300309;4. 武警特色医学中心,天津 300162)

支气管哮喘简称哮喘,哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的呼吸系统疾病,其临床症状表现为反复发作的喘息、呼吸困难、胸闷和咳嗽等[1-2]。世界卫生组织发布的《全球哮喘负担报告》显示全球大约有3亿人口患有哮喘疾病,估计到2025年世界范围内将增加至4亿哮喘患者[3]。哮喘疾病是仅次于癌症的全球第二大致死和致残疾病。西医对哮喘的治疗主要通过皮质激素类药物缓解哮喘的急性发作,但是患者若长期服用此类药物,容易产生不良反应甚至致使病情加重[4]。哮喘与中医“哮病”理念有着紧密的联系,其主要的发病机制归结于肺部有痰,痰因肺脾肾功能失常,津液凝聚而成。现代中医研究支气管哮喘常基于肺和肾虚、痰湿疾病来讨论气道炎症、气道重塑等病理特征然后提供不同的预防和治疗方法。中医药在治疗哮喘方面独具特色,不仅能通过抑制气道炎症和舒张支气管来治疗哮喘,而且在治疗哮喘的同时还能提高患者的自身免疫力[5-6]。中药淫羊藿味辛、甘,性温,归肝、肾经。不仅具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效[7],还具有抗衰老、增强免疫的功效[8]。女贞子甘、苦,性凉,归肝、肾经,具有滋补肝肾、明目乌发的功效[9]。根据中医“久病成虚”“缓则治本”的理论,平补肾中阴阳立法的药对淫羊藿-女贞子是名老中医徐辉光教授积30余年临床之经验而精选创制[10],临床4∶3配伍作为支气管患者缓解期用药。研究发现淫羊藿和女贞子配伍能减轻哮喘大鼠气道重塑的病理改变,改善胶原沉积和杯状细胞增生的现象[11]。目前尚未有系统研究淫羊藿-女贞子治疗哮喘作用机制的相关报道。本研究利用网络药理学及分子对接技术探讨淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的核心成分以及作用机制,为淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的药效物质基础和作用机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1淫羊藿、女贞子的活性成分及靶点的获取 利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索中药淫羊藿、女贞子的化学成分。以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和类药性(drug likeness,DL)这两个重要的药代动力学参数对其进行初步筛选。通过筛选标准“OB≥30%,DL≥0.18”筛选淫羊藿-女贞子药对的活性化合物,整理化合物的名称以及Mol ID等信息,并收集化合物的对应靶点。通过Uniprot(https://www.uniprot.org)数据库对收集的靶点进行统一标准化,设置条件“Reviewed (Swiss-Prot)”并选择人源性基因,获得淫羊藿、女贞子成分靶蛋白对应的靶基因。

1.2哮喘相关靶点的获取 利用GeneCards(https:/www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)和DisGeNet(https://www.disgenet.org/)数据库以“asthma”“bronchial asthma”为关键词,检索并收集哮喘靶点。为了排除与疾病低关联的靶点对于后续研究的干扰,在GeneCards中筛选Relevance score值大于中位数且种类为protein coding为筛选条件,以及在DisGeNet中将Score大于中位数的疾病靶点纳入到本研究哮喘靶点的范围,最后将从3个数据库收集的哮喘靶基因去重、汇总后获得哮喘作用靶点。

1.3淫羊藿-女贞子药对与哮喘交集靶点的获取将收集的淫羊藿、女贞子成分靶基因汇总去重后,获得淫羊藿、女贞子及淫羊藿-女贞子药对成分的靶基因,然后与哮喘疾病靶基因汇总,将其导入Venny 2.1.0在线平台并绘制淫羊藿、女贞子以及药对作用靶点与哮喘靶点的交集基因韦恩图。将淫羊藿-女贞子药对与哮喘疾病的交集靶点输出作为淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的潜在靶点。

1.4构建“药物-成分-靶点”网络 通过Cytoscape 3.9.1软件建立“药物-成分-靶点”网络,并通过可视化网络拓扑分析获得关键成分。利用软件的附加功能计算网络图的度值(degree centrality,DC)和中间中心性(betweenness centrality,BC)和接近中心性(closeness centrality,CC)。将药物、成分及靶点的作用关系进行网络拓扑学分析并可视化,以此来评价淫羊藿-女贞子药对中活性成分和对应靶点的重要程度,从而探讨其所含的化合物治疗哮喘潜在的作用机制。

1.5构建蛋白相互作用网络图 将淫羊藿-女贞子药对与哮喘的交集靶基因上传至STRING(https://cn.string-db.org/)数据库,建立交集基因的蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络。设定Organism为“Homo sapiens”,最低相互作用阈值为“medium confidence 0.400”,并隐藏网络中没有相互联系的节点,下载tsv.格式的PPI网络文件。利用Cytoscape 3.9.1软件对PPI网络进行可视化分析。基于CytoNCA插件以Degree值进行网络拓扑分析,筛选核心靶点并绘制蛋白频次条形图。

1.6基因本体富集和通路分析 为了研究淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的潜在靶点的生物学功能,本研究使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov)数据库进行基因本体(gene ontology,GO)富集和KEGG通路分析。将淫羊藿-女贞子药对的成分靶基因与哮喘靶基因的交集基因上传至DAVID数据库,设定物种为人类,然后进行GO富集和信号通路分析,并借助微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)对富集的结果进行绘图。

1.7分子对接 将从1.4获得的核心成分前6名与从1.5获得的排名靠前的6个核心靶点进行分子对接。在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载核心活性成分的3D结构,经Chem 3D 20.0软件能量最小化处理后保存为.pdb格式;从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心靶点的晶体结构(PDB格式),IL-6(PDB ID:1ALU)、JUN(PDB ID:1JNM)、IL1B(PDB ID:6Y8M)、Akt1(PDB ID:6S9W)、VEGFA(PDB ID:4KZN)、TP53(PDB ID:7B4E);运用Pymol软件对核心靶点进行去水和残基配体、只保留裸蛋白的操作,再利用AutoDock 1.5.6软件对核心靶点进行去水、加氢操作保存为.pdbqt格式,对核心成分进行去水、加氢和设置扭转键操作保存为.pdbqt格式;最后运行AutoDock vina进行分子对接,将所有对接结果按照结合能大小排序,选择结合能较小的对接结果输出到Pymol软件绘制对接结果的构象图。

2 结 果

2.1淫羊藿-女贞子药对活性成分以及靶点的获取 利用TCMSP数据库筛选淫羊藿-女贞子药对的活性成分。从TCMSP数据库检索得到淫羊藿130个化合物,女贞子119个化合物。以筛选条件(OB≥30%,DL≥0.18)筛选得到淫羊藿-女贞子药对活性成分33个,见表 1。其中淫羊藿包含23个活性成分,女贞子13个活性成分,3个共有成分即木犀草素(MOL000006-luteolin)、槲皮素(MOL000098-quercetin)、山柰酚(MOL000422-kaempferol)。利用Uniprot数据库将从TCMSP数据库获得的靶点蛋白名称转化成基因名称。将得到的人源性基因去重、汇总后,获得淫羊藿-女贞子药对共225个成分靶基因,其中淫羊藿成分靶基因217个,女贞子成分靶基因195个。

2.2哮喘疾病靶基因的收集 从Genecards数据库收集得到1 382个哮喘疾病靶基因,OMIM数据库得到43个哮喘靶基因,DisGenet数据库得到792个哮喘靶基因,去重、汇总后共得到1 720个哮喘疾病相关的靶基因。

2.3淫羊藿、女贞子及淫羊藿-女贞子药对与哮喘交集基因 将淫羊藿、女贞子成分靶基因以及哮喘靶基因上传到在线韦恩图绘图平台,获取药物成分与疾病的交集基因。通过在线韦恩图(图1A),得出淫羊藿活性成分与哮喘的共有靶基因125个,女贞子活性成分与哮喘的交集靶基因115个,淫羊藿-女贞子药对活性成分与哮喘共有靶基因126个(图1B),将126个靶基因视为淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的潜在靶点。

图1 淫羊藿、女贞子以及药对作用靶点与哮喘靶点的交集基因韦恩图

表1 淫羊藿-女贞子活性成分的基本信息

2.4“药物-成分-靶点”网络构建 利用Cytoscape 3.9.1软件构建淫羊藿-女贞子药对的成分-靶点网络图,见图2。在网络图中节点代表药物、活性成分和作用靶点;节点间的连线连接药物、成分和靶点,体现其相互关联性。该网络图中有节点258个,边612条。利用Cytoscape 3.9.1软件的Network Analyzer功能对网络图进行分析,成分的平均Degree值为4.67,即每个成分约与5个靶点相连。对于网络中的节点来说,一个节点的Degree值越大,表明其在网络中的重要性越高,再结合网络中成分节点的CC值和BC值来共同判断节点的重要程度。按照“Degree值≥2倍中位数(Degree≥20)”筛选核心成分,槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、2,7-二氢高刺桐春(C-Homoerythrinan, 1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-, (3.beta.)-)、脱水淫羊藿素(Anhydroicaritin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等化合物可能是淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的关键成分,见表 2。

注:菱形节点表示淫羊藿-女贞子药对的活性成分;圆形节点表示活性成分对应的靶点;六边形节点表示中药淫羊藿和女贞子

2.5PPI网络构建 将126个淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的潜在靶点导入STRING数据库,获得PPI网络数据,然后利用Cytoscape 3.9.1软件对PPI网络进行可视化分析,见图3。并基于拓扑分析的参数筛选核心靶点,将Degree值≥2倍中位数(Degree≥68)的有效靶点定义为核心靶点,IL-6、Akt1、TP53、VEGFA、IL1B等靶点可能是淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的关键靶点,见图4。

图3 淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘潜在靶点的PPI网络

图4 淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的核心靶点

表2 淫羊藿-女贞子药对的核心成分及拓扑参数

2.6GO富集和KEGG通路分析 通过DAVID数据库对126个淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的潜在靶点进行基因本体(GO)富集和KEGG通路分析。基因本体包含3个本体(ontology),分别为生物学过程(biological process,BP)、所处位置的细胞组成(cellular component,CC)和所发挥的分子功能(molecular function,MF)。基于P<0.05,共获得493个生物过程(BP)条目,63个细胞组成(CC)条目,99个分子功能(MF)相关的条目,147条淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘潜在靶点富集的通路。

对排名前10的GO分析条目绘制柱状图进行分析(见图5),结果显示GO分析主要富集在对细胞增殖、基因表达的正向调节、凋亡过程的负向调节、血管生成、炎症反应、对缺氧的反应等生物学过程,细胞外、膜筏、转录因子复合体和大分子复合体等细胞组成,以及酶结合、蛋白质结合、血红素结合、细胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性等分子功能。

图5 淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘潜在靶点的GO富集分析

对排名前20的信号通路绘制气泡图进行分析(见图6),结果显示淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘可能与AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(AGE-RAGE信号通路)、IL-17 signaling pathway(IL-17信号通路)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt信号通路)、TNF signaling pathway(TNF信号通路)、Th17 cell differentiation(IL-17细胞分化)、C-type lectin receptor signaling pathway(C型凝集素受体信号通路)等通路有潜在关联。

图6 淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘潜在靶点的KEGG通路分析

2.7分子对接分析 一般认为结合能<0 kcal/mol提示配体与受体有一定的结合能力,结合能<-5 kcal/mol提示配体与受体有较好的结合活性。根据分子对接结果(见表3),除了β-谷甾醇、脱水淫羊藿素和2,7-二氢高刺桐春与VEGFA蛋白的结合能>-5 kcal/mol,核心成分与IL-6、Akt1、TP53、IL1B和JUN的结合能均<-5 kcal/mol,说明淫羊藿-女贞子药对的有效成分与核心靶点具有较好的结合活性,并且有效成分与Akt1蛋白有很好的结合能力。此结果证明淫羊藿-女贞子药对是通过药物多成分-多靶点发挥治疗哮喘的功效。利用Pymol软件绘制对接结果的构象图(见图7)。

A:IL-6与木犀草素;B:Akt1与β-谷甾醇;C:TP53与脱水淫羊藿素;D:IL1B与木犀草素;E:VEGFA与木犀草素;F:JUN与槲皮素

表3 淫羊藿-女贞子药对核心成分和核心靶点对接的结合能结果(kcal/mol)

3 讨 论

《医宗必读》云:“肾为先天之本。”若肾脏精气阴阳不足,即肾虚,则会使机体失卫,外邪趁机而入,肺为娇脏,最易受邪,邪郁于肺卫,肺失宣降,从而诱发哮喘。中西医结合专家沈自尹通过调查研究认为,哮喘患者普遍存在肾脏精气阴阳不足的现象,部分患者表现为阴虚哮喘。淫羊藿、女贞子作为常用的延缓衰老的补肾中药,两药配伍可平补肾中阴阳,用于肾虚型哮喘具有较好的治疗效果。本研究利用网络药理学和分子对接的方法,预测淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的药效成分、靶点和通路,阐释其作用机制,为淫羊藿-女贞子治疗哮喘的进一步研究提供参考。

由药物-化合物-靶点网络图可知,槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、脱水淫羊藿素等成分在网络中具有重要作用,表明这些成分可能是淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的关键成分。槲皮素具有抑制组胺和促炎介质分泌的抗过敏作用。槲皮素可调节哮喘疾病中Th1/Th2的平衡,减少B细胞释放抗原特异性IgE抗体发挥抗炎和免疫调节的作用,适用于哮喘的治疗[12]。研究表明山柰酚在呼吸系统疾病模型(哮喘、急性肺损伤和慢性阻塞性肺疾病等)具有抑制黏液分泌、减轻气道炎症反应的作用[13-15]。木犀草素作为黄酮类化合物在哮喘疾病的治疗中发挥抗炎、抗过敏和增强免疫的活性。木犀草素能够影响多种炎症相关通路的表达,减少炎症因子的活性,以达到缓解炎症的作用[16]。木犀草素可以通过抗氧化应激和抑制COX-2信号通路[17],抑制TLR4/NF-κB[18]途径抑制气道炎症,还可以抑制MAPK通路改善哮喘大鼠的气道重塑病理过程[19]。β-谷甾醇已被证明具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及潜在的抗哮喘作用,能够改善卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘豚鼠导致的肺功能障碍,减少肺泡灌洗液的炎性浸润和抑制TNF-α、IL-4和IL-5的炎症因子分泌改善Th2型气道炎症[20]。另外,β-谷甾醇通过抑制IL-17A的分泌和提高IL-35的水平而调节Th17/Treg免疫失衡[21]。脱水淫羊藿素对由脂多糖(LPS)诱导而活化的巨噬细胞释放IL-6、TNF、MCP-1等促炎细胞因子的病理过程具有抑制作用[22],对活化的小鼠T淋巴细胞具有抑制作用以及抑制IL-6、IL-10等细胞因子分泌,表明脱水淫羊藿素具有潜在的免疫抑制作用[23]。

由PPI网络可知,淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的核心靶点包括IL-6、Akt1、TP53、VEGFA、IL1B、JUN等。IL-6是由巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等分泌的细胞因子,具有免疫调节作用、反应机体的炎症反应和抗肿瘤效应。IL-6参与哮喘的发生发展,研究发现哮喘患者在急性发作时体内的IL-6明显升高[24]。Akt1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)被激活。抑制Akt1的激活可以改善过敏性哮喘的气道炎症反应[25]。TP53是一种抑癌基因,迟发性哮喘患者外周血中叉头盒状O转录因子3(FOXO3)和TP53的mRNA表达有明显差异,可能与DNA甲基化的调节有关。FOXO3和TP53甲基化是预测迟发性哮喘患者血液中的生物标志物,并且可能是迟发性哮喘的诊断和临床治疗的有效靶点[26]。血管内皮生长因子A(VEGFA)存在于血管内,是由血管内皮细胞分泌产生,在血管通透性和肺血管增殖方面发挥重要作用,影响哮喘气道重塑发展的病理过程[27]。IL1B可以增加内皮细胞对嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等细胞的黏附力,而内皮细胞遍布于全身各处,是炎症反应中各类物质相互作用的交汇点。另外,IL1B能促进炎症细胞的活性,尤其是单核细胞,调节炎性细胞的转运和活化而参与炎症反应[28]。JUN家族包含c-JUN、JUNB、JUND蛋白,c-JUN也是转录因子AP-1家族的成员,是AP-1复合物中最具有转录活性的转录因子,AP-1与DNA结合后调控多种基因的表达,可以通过调节VEGF、基质金属蛋白酶等因子的表达,参与哮喘气道重塑的发展变化[29]。

由KEGG通路分析可知,与哮喘相关的通路有AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等。AGE-RAGE信号通路是一种重要的炎症通路,该通路可以激活NF-κB传导途径,促进炎症因子释放(比如TNF-α),参与哮喘的发生、发展[30]。IL-17信号通路参与中性粒细胞诱导的哮喘[31]。PI3K-Akt信号通路通过调控嗜酸性粒细胞浸润、气道杯状细胞增生和黏蛋白MUC5AC等细胞和细胞因子的表达而参与气道黏液高分泌过程[32]。TNF信号通路通过调控气道炎症和气道重塑参与哮喘的病理变化过程。Th17细胞在炎症发生过程中可以分泌大量IL-17,诱导巨噬细胞的聚集,引发炎症反应[33]。Th17细胞通过诱导IL-6、TNF-α等炎症因子的表达,参与哮喘等疾病的发生[34]。

本研究借助网络药理学和分子对接技术,预测了淫羊藿-女贞子药对治疗哮喘的主要活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素、2,7-二氢高刺桐春、脱水淫羊藿素等,可能通过作用于IL-6、Akt1、TP53、VEGFA、IL1B等靶点以及作用于IL-17通路、PI3K-Akt通路和TNF通路等多个信号通路发挥治疗哮喘的作用。但由于筛选成分时未考虑多种成分之间的相互作用,以及数据库信息存在滞后性和不全面性,使得研究具有一定的局限性,后期需要进行分子生物学实验对网络药理学和分子对接预测的结果进行验证,以明确其作用机制。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。