转录组学技术在肺动脉高压发生发展及诊治中的应用进展

孟英，肖根发

1 赣南医科大学第一临床学院，江西赣州 341001；2 赣南医科大学第一附属医院心血管内科；3 赣南医科大学心脑血管疾病防治教育部重点实验室

肺动脉高压（PAH）是一种慢性进行性疾病，具有高病死率，其病理生理学改变主要是肺血管重构，该过程涉及肺血管内皮细胞（PVECs）增生、肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）过度增殖和迁移、外膜成纤维细胞增生以及细胞外基质沉积等［1］。随着对PAH研究的深入，目前研究发现炎症免疫反应也与PAH的发病密切相关［2］。这些病理生理学异常改变会促使肺动脉管壁增厚、管腔狭窄，进而引起肺血管阻力增加、肺动脉压持续升高，最终导致右心室扩张、右心功能衰竭甚至死亡。右心导管检查是诊断PAH的金标准，但其具有有创性，存在检查风险大、患者依从性差及短时间不能重复检查等缺点。近年来，靶向治疗已应用于PAH的治疗，但患者预后仍然较差。转录组是指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA，是连接基因组遗传信息与蛋白质组生物功能之间的纽带。转录组学能够揭示基因在特定生理或病理状态下的表达水平和模式，从而深入了解基因在生物体内的功能和调控机制。目前，转录组学的研究方法主要包括基于杂交的基因芯片技术（又称为DNA微阵列，DNA microarray）和转录组测序（RNA-seq）。随着高通量测序技术的进步和成本的降低，RNA-seq逐渐取代传统DNA microarray，广泛应用于分子生物学研究［3］。本研究对与PAH发生发展及诊治有关的转录组学相关研究作一综述，为探讨PAH的发病机制、诊断及治疗提供依据。

1 转录组学技术在PAH发病中的应用

1.1 转录组学技术在肺动脉血管重构中的应用

1.1.1 转录组学技术在PVECs功能障碍中的应用 PVECs功能障碍会引起血管重构，是导致PAH发生的关键［4］。首先，内皮细胞（EC）位于血管最内层，直接接受血流冲击和各种致病因素的刺激，从而诱导EC增殖能力及通透性升高，并通过分泌各种因子引起炎症和免疫细胞募集，激活细胞凋亡抵抗［5-6］。其次，PVECs功能失调可引起上皮—间质转化（EMT），该过程是以内皮细胞丧失功能并获得间充质细胞表型（如平滑肌细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞样细胞）为特点［7］。2015年，GU等［8］首次通过DNA microarray的方法比较了慢性血栓栓塞性PAH（CTEPH）患者与健康对照人群PVECs中的lncRNA、mRNA表达谱，并构建了lncRNA-mRNA共表达网络；结果显示，与健康对照人群相比，CTEPH患者PVECs中有185个lncRNA表达异常，其中差异最大的4个lncRNA分别是NR_036693、NR_027783、NR_033766和NR_001284，这些异常的lncRNA可能是与CTEPH发生发展相关基因的激活物或抑制物。

RODOR等［9］对SU5416/缺氧诱导的PAH小鼠和正常对照小鼠肺EC进行了单细胞转录组测序分析，结果发现了222个差异表达基因；同时，该研究对PVECs进行了RNA-seq分析，结果发现CD74表达上调与MHC-Ⅱ基因有关，CD74/MHC-Ⅱ复合物参与了PAH的形成过程，且CD74敲低可以影响PVECs的增殖和屏障功能，为PAH潜在候选治疗药物的开发提供了新靶点。HE等［10］对缺氧性肺动脉高压（HPH）诱导后的小鼠肺部EC亚群进行转录组测序分析，结果筛选出羟基前列腺素脱氢酶（Hpgd）、Npr3和Fbln2三个关键基因，最终选择Hpgd进行后续验证；通过对人肺动脉内皮细胞（hPVECs）进行不同时间的缺氧处理发现，Hpgd表达呈时间依赖性降低。因此，临床上可以通过监测hPVECs中Hpgd表达情况，以此反映PAH病情，并用于指导后续治疗。最近研究发现，糖酵解蛋白烯醇酸酶1（ENO1）可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路参与PAH的血管重构。SHI等［11］采用RNA-seq筛选出缺氧处理后PVECs的差异表达基因，并使用ENO1抑制剂恢复了缺氧诱导的PVECs功能障碍，提示靶向抑制ENO1过表达可改善PAH的血管重构，有希望成为新的PAH治疗靶点。MONTEIRO等［12］同样通过RNA-seq发现PTBP1通过介导lncRNA_MIR503HG在EMT中发挥作用，从而参与PAH的肺血管重构。因此，PVECs功能紊乱在PAH的早期发病过程中起着至关重要的作用，深入了解PVECs在肺血管重塑中的作用对于PAH的预防、诊断及治疗均具有重要意义。

1.1.2 转录组学技术在PASMCs增殖、迁移中的应用 PASMCs过度增殖和迁移所引起的肺血管重构是PAH发生的中心环节［1］。近年来有研究通过DNA microarray发现，在缺氧条件下过表达尿路上皮癌相关1基因（UCA1）与生长抑制因子家族成员5（ING5），可通过竞争人异质性细胞核核糖核蛋白Ⅰ（hnRNPⅠ）来促进原代肺动脉平滑肌细胞（HPASMCs）增殖，并抑制细胞凋亡，最终导致PAH进展［13］。一项关于lncRNA数据的研究显示，缺氧暴露的PASMCs中lncRNA-MALAT1表达升高，并可能是受到HIF-1α的调控，敲低MALAT1可抑制PASMCs体外增殖和迁移，减轻PAH小鼠的右心室肥厚［14］。LUO等［15］通过RNA-seq检测了正常和HPH大鼠的差异表达mRNA，结果显示二氧化硫（SO2）通过Dkk1/Wnt信号通路抑制PASMCs的增殖和迁移，从而减轻缺氧诱导的肺小动脉重构。此外，有研究对18例IPAH患者和17例健康对照人群的肺动脉血管进行转录组测序，结果发现IPAH患者PASMCs和成纤维细胞中PAX相互作用蛋白1反义RNA1（PAXIP1-AS1）表达异常；PAXIP1-AS1可通过靶向调节细胞骨架蛋白paxillin表达和磷酸化，从而调节PASMCs增殖、迁移和细胞凋亡抵抗［16］。ZHENG等［17］对野百合碱（MCT）诱导的PAH大鼠进行了单细胞RNA测序，结果筛选出PVECs、PASMCs、成纤维细胞、巨噬细胞、NK细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞（Tregs）中差异表达的N6-甲基腺苷RNA甲基化（m6A）调节因子，提示m6A调节因子参与了PAH的发生发展，可能是PAH诊断和治疗的生物标志物之一。LV等［18］分析了常氧和缺氧条件下PVECs、PASMCs和周围细胞（PCs）中的lncRNA转录组表达谱，结果显示在缺氧条件下lncRNA牛磺酸上调基因1（TUG1）在PASMCs、PCs中表达升高，而在PVECs中表达降低；生物信息学分析结果显示，lncRNA-TUG1可能通过靶向调节miR-145-5p，促进PASMCs的增殖和迁移，并抑制细胞凋亡，从而加速肺血管重构。WANG等［19］研究发现，PAH患者和HPH小鼠肺血管中TUG1高表达，TUG1敲低可阻止PAH的进一步发展。环状RNA（circRNAs）可以调节各种生物过程，包括细胞增殖过程。SUN等［20］采用RNA-seq筛选出与HPH相关的circRNA和靶基因，结果表明circ-Grm1通过RNA结合蛋白FUS蛋白抑制Grm1表达，从而促进PASMCs的增殖和迁移，参与PAH的发生发展。因此，临床上可以通过靶向调节PASMCs中的相关基因表达来逆转PAH的血管重构。

1.2 转录组学技术在肺组织炎症免疫中的应用肺部血管周围炎症反应程度与肺血管重构密切相关，故炎症细胞在PAH的发生发展过程中至关重要。XIAO等［21］采用RNA-seq分析了MCT诱导的PAH大鼠肺组织基因表达谱，结果显示炎症因子Svop、Ercel、Erfe、Dlk1、ccl1、ccl2、ccl20表达上调，并提出失调的炎症/免疫和神经活性配体—受体相互作用可能参与了PAH的发生发展。AREG是编码双调蛋白的关键内皮因子，AREG/EGFR轴参与了许多炎症疾病的发病。有研究对PAH小鼠PVECs的全转录组测序进行分析发现，AREG及其受体EGFR在EC中表达缺失，引起PAH中炎症细胞募集，导致肺血管重构［22］。ZHANG等［23］通过对肺组织转录组的生物信息学分析显示，miR-483靶向调节多个与PAH相关的炎症基因，包括转化生长因子β（TGF-β）、TGF-β受体2（TGFBR2）、β-catenin、结缔组织生长因子（CTGF）、白细胞介素1β（IL-1β）和内皮素1（ET-1）等，提示miR-483可能成为治疗PAH的新靶点。

1.3 转录组学技术在PAH导致右心功能衰竭中的应用 在PAH引起右心功能衰竭的过程中，早期心室因代偿而肥厚，晚期因失代偿而发生衰竭。右心功能衰竭是影响PAH预后的决定因素，尽管目前针对肺血管的治疗已使PAH导致右心功能衰竭患者的症状有所改善，但患者生存率仍然较低［24］。研究发现，EMT通路和CTGF蛋白在PAH引起右心功能衰竭的过程中活性升高［25］。salubrinal是一种小分子，可以阻止真核翻译起始因子2α（peIF2α）去磷酸化，从而延长细胞寿命。HE等［26］通过RNA-seq分析大鼠基因表达变化，结果显示peIF2α去磷酸化抑制剂salubrinal可以预防和逆转PAH导致的右心功能衰竭。上述转录组学相关研究有助于更好地了解PAH导致右心功能衰竭的分子机制，并为其治疗提供新的靶点。

2 转录组学技术在PAH诊治中的应用

2.1 转录组学技术在PAH诊断中的应用 目前临床上常用的PAH诊断方法是超声心动图和右心导管检查。既往研究发现，超声心动图诊断PAH的敏感度和特异度均不高，分别为90%、75%。右心导管检查是诊断PAH的金标准，但其具有有创性，不能成为常规筛查方法。随着越来越多的研究试图揭示PAH的发病机制，与以往的生化指标和炎症因子相比，转录组学相关生物标志物的特异性更高。WANG等［27］运用DNA microarray技术发现HPH小鼠具有23个上调的circRNA和41个下调的circRNA，其中表达上调的hsa cric-004592和hsa cric-018351有望成为PAH早期诊断的生物标志物。一项研究对359例特发性、遗传性和药物性相关的PAH患者和健康对照人群的全血细胞进行了RNA测序，结果筛选出了507个差异表达基因，在模型中验证发现25个差异表达基因诊断PAH的敏感性为87%；并提出PAH的全血RNA特征与疾病严重程度相关，其中SMAD5表达降低可能会增加PAH的易感性，而SMAD5是TGF-β家族细胞质内重要的信号转导分子，提示SMAD5是PAH相关药物开发的潜在靶标［28］。PARK等［29］对PAH大鼠肺组织进行全转录组测序发现，68Ga-NOTA-MSA PET可以通过对巨噬细胞浸润肺部的程度进行成像，并以此帮助诊断PAH、监测炎症程度，有可能成为诊断PAH的新型指标。胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）是胰岛素样生长因子家族的重要成员，有研究采用RNAseq检测肺PASMCs和PVECs中的IGFBP2 mRNA表达情况，结果显示IGFBP2蛋白是由PASMCs分泌，并且在PAH肺组织中表达升高，与PAH严重程度和病死率密切相关，其诊断PAH的受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.76，是诊断PAH的潜在标志物之一［30］。此外，XU等［31］收集了26例CTEPH患者和35例健康志愿者的全血样本，并提取RNA来构建文库，结果显示LINC00472、PIK3R6、SCN3A、TCL6诊断CTEPH的AUC分别为0.964、0.893、0.750、0.732。因此，转录组学可以为PAH的诊断提供有效的生物学标志物。

2.2 转录组学技术在PAH治疗中的应用 目前，临床上对于PAH的治疗主要通过靶向药抑制内皮素途径、增强前列环素（PGI2）和磷酸二酯酶5抑制剂途径来纠正内皮细胞功能障碍，从而改善症状和提高患者生存率［32］。同时，随着关于PAH发病机制的转录组学研究不断深入，一些新的治疗靶点逐渐被发现。基质细胞衍生因子1（SDF1）是一种参与炎症浸润和血管生成的趋化因子，而PAH小鼠血管壁细胞（平滑肌细胞和周细胞的统称）中的SDF1与血管肌肉化有关，靶向调节血管壁细胞中的SDF1表达有助于预防和（或）逆转PAH病程，是PAH的新型治疗靶点［33］。此外，芳香烃受体（AHR）是一种核受体/转录因子，可解除外源性物质，并调节各种免疫细胞的分化和功能。MASAKI等［34］研究发现，PAH中炎症细胞浸润以AHR依赖性的方式而发挥作用。因此，AHR在PAH的发生发展中起着至关重要的作用，可能会成为治疗PAH的一个有效靶点。

综上所述，转录组学能够全面揭示基因在生物体内的功能和调控机制，不仅可以参与揭示PAH的发生发展机制，还可以为其诊治提供新的特异性诊断标志物和潜在的治疗靶点，对提高患者的生存质量以及改善预后具有重要作用。