宏基因组二代测序在肺部感染患者病原体检测中的价值

戴新刚

溧阳市中医医院呼吸科，江苏溧阳 213300

判断肺部感染患者病因种类时，可采取痰液培养、支气管灌洗液涂片等方式，其于临床上应用广泛且操作简便，适合于早期快速筛查工作，同时还可配合血液检查、肺部影像检查等结果综合评估病情[1]。既往研究发现，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、支原体等导致的肺部感染概率最高，尤其是在抗生素类制剂尚未被发现之前，肺炎链球菌是肺部感染的最常见原因[2]。但传统方法实际操作时会受到多种客观因素的影响，继而导致阳性率波动，加之可能存在混合感染的情况，使得诊断准确率难以满足现代治疗的需求。宏基因组二代测序（Metagenomic Next-generation Sequencing, mNGS）技术则是直接通过对样本中的核酸物质给予测序，从而获取感染源的遗传信息，在判断感染源的工作中能够发挥指导作用[3]。本研究选取溧阳市中医医院呼吸科于2022年1—12月收治的70例疑似肺部感染患者作为研究对象，探讨mNGS用于病原体检测的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院收治的70例疑似肺部感染患者作为研究对象。其中男39例，女31例；年龄25～72岁，平均（49.85±3.77）岁；入院时58例患者症状表现为剧烈咳嗽，22例患者发热，6例患者咳血。本研究已获得医院医学伦理委员会审核（2021LY-12-20-01）。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①通过肺部CT等影像检查及临床综合诊断疑似肺部感染疾病；②抽血检查存在血象升高情况；③临床资料完整；④对本研究知情同意。排除标准：①合并支气管疾病患者；②合并肺部肿瘤疾病患者；③合并自身免疫性疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 mNGS检测 ①标本采集：需由院内拥有临床操作经验至少5年的纤维支气管镜医师负责实施。先为患者开展纤支镜下的肺泡灌洗手术，选择地西泮（国药准字H41020631；规格：2 mL∶10 mg×10支/盒）5 mg肌注适当镇静，随后经由鼻腔向支气管内置入纤支镜，观察病灶所在的支气管或肺内情况，期间通过利多卡因给予黏膜局部麻醉，以最大程度控制不适感。根据病变程度由重至轻实施关系，注射适温生理盐水，剂量控制在60～120 mL，再以正负压反复抽吸，压力控制在100 mmHg左右。灌洗完成后将灌洗液回收备用，回收率需达到40%～60%，回收量需＞10 mL。将回收的灌洗液转移至灭菌后的密封容器中，并立即实施冰冻保存，转运至检验机构内开展mNGS检测，所有操作均需按照检验机构出具的标准执行。②检测方法：检测时需提取3～5 mL灌洗液样本，将其转移至离心管内，置入离心机内进行处理，离心机内环境温度需控制在4℃，离心速率设定为4 000 r/min，连续离心10 min后提取沉淀物样本。使用mNGS相关试剂盒，根据说明书内操作标准对样本中的DNA碎片进行提取。首先需将样本经超声破碎处理，使DNA片段保持在150 bp左右即可，再借助Agilent 2 100型质控文库插入200～300 bp的DNA片段，经环化处理后获得单链环状结构的遗传物质。环化处理后还需进一步使用文库开展滚环式复制，以此生成DNB纳米球。将制备好的纳米球加载至测序芯片中，使用配套软件对DNA序列进行测量，测序时需将长度＜35 bp的低质量片段去除，以此确保测序数据的整体质量。再通过测序库和人类参考DNA基因组进行对比，将属于人类的基因序列清除，随之获得感染源的DNA序列，再将其与细菌、真菌、病毒、寄生虫的基因库进行对比，从而确定感染源的具体种类。

1.3.2 痰培养 由护理人员负责采集患者的痰液样本，最好取晨起时的第1口痰液，采样前先清水漱口，去除口腔内杂菌，指导患者咳嗽方法，咳出呼吸道深部痰液样本，密封后送往检验科室。检测严格遵照标准流程进行细菌培养和分离，使用PROBACT-K自动化细菌分离培养仪和西门子WalkAway-40plus全自动细菌鉴定及药敏分析系统，鉴定分离出的细菌并进行药品试验，并参照美国临床实验室标准化协会2012标准判读结果。

1.4 观察指标

①准确率、灵敏度、特异度。以细菌培养结果为金标准，比较mNGS技术、痰培养结果与金标准针对病原体的检出率。灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%；准确度=（真阳性例数+真阴性例数）/总例数×100%。

②mNGS与痰培养对病原体诊断符合率的比较。

1.5 统计方法

采用SPSS 28.0统计学软件进行本文研究数据的处理，诊断符合率、诊断效能（灵敏度、特异度、准确度）为计数资料，以例数（n）和率（%）表示，差异比较行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检查方法的诊断效能比较

经细菌培养结果显示，70例疑似肺部感染患者中，有50例确诊肺部感染疾病，20例未感染；mNGS灵敏度、特异度及准确率均明显高于痰培养，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

2.2 两组检查方法的诊断符合率比较

经细菌培养结果显示，检出铜绿假单胞菌18例、肺炎链球菌12例、曲霉菌8例、结核分歧杆菌6例、非结核分歧杆菌6例，mNGS检测与经痰培养检验符合率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两种检查方法对病原体诊断符合率对比（%）

3 讨论

由于肺部与外界始终存在气体交换，因此很容易受到外界病菌的侵入，从而产生肺部感染类病变。该病症可由多种病原体引发，包括细菌、病毒、真菌等，临床治疗时需先对感染源的种类、耐药性等特征给予确认，从而实施针对性的干预，以提升整体治疗效果。肺部感染属于呼吸系统中最常见的病变之一，病情较轻者通过常规的抗感染治疗即可快速痊愈，而病情较重的群体则很可能威胁生命安全[4-5]。临床在治疗肺部感染时可通过应用广谱抗菌药物以抑制病原体的生长，但若病情较为严重或存在耐药菌的情况，则广谱抗菌药物的治疗效果不佳，甚至可能诱发多重耐药菌株的产生，给后续治疗带来更大的难题[6-7]。为此，针对中度及以上的肺部感染患者，可先实施广谱抗菌药物抑制病菌的生长速度，再针对感染源种类给予检测，参考检测结果选择相应的窄谱抗菌药物实施针对性治疗。

病原体检测的常用方式包括痰液样本培养、灌洗液样本涂片培养等，其操作简便，在医院内即可完成[8-9]。但在实际应用时受外界客观因素影响严重，导致检出率有所下降。mNGS技术则是利用对灌洗液中包含的病原体遗传物质进行测序，从而准确判定病原体的具体种类[10-12]。本研究结果显示，mNGS检测对病原体检出率（准确率98.57%）高于痰培养（P＜0.05），这与张安兵等[13]研究结果一致，观察组病原体检出率（92.85%）高于对照组（P＜0.05）。说明运用mNGS检测可以提升病原体的检出率，尤其是少见病原菌的检出。分析原因：痰培养以往被视为诊断感染性疾病的金标准，但临床实践中，由于标本收集不合格、标本保存不当致病原菌死亡，加之部分微生物不能培养的特性，以及痕菌量少无法被检测等原因，导致痰培养存在假阴性结果[14-15]。而mNGS技术能够在单次检测中对数百万条遗传物质给予测序，从而获得样本中所有病原体的基本信息，其检出率、灵敏度、检验速度均相对较高，且不会受到宿主个体差异、是否使用抗菌药物等客观因素的影响，大幅提升病原体检测的准确度[16-18]。

综上所述，宏基因组二代测序技术可以有效规避传统痰培养的假阴性问题，以此提高肺部感染患者病原体种类的诊断准确度。