一测多评法同时测定蒲元和胃胶囊中7 种成分含量

李怀伟，王 劲，任仲丽，朱伟堃，张 朋

（山东省菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000）

蒲元和胃胶囊由延胡索、香附、醋乳香、蒲公英、枯矾、甘草6 味药材组方，具有行气止痛、疏肝和胃等功效［1-3］。目前，蒲元和胃胶囊的研究主要集中于临床疗效及延胡索乙素含量测定［4］。2020 年版《中国药典（一部）》中对蒲元和胃胶囊的质量控制指标主要为延胡索、香附、醋乳香、蒲公英、甘草药材的薄层色谱（TLC）法定性鉴别和药材的活性成分延胡索乙素（延胡索）、甘草酸（甘草）的含量测定，能较全面地控制药品质量，但检验所用对照药材和对照品较多，成本较高，且含量测定指标较少。一测多评法通过建立内参物与其他成分间的相对校正因子，同时测定多指标成分［5-6］，可降低检验成本，更全面控制制剂质量。本研究中建立了同时测定蒲元和胃胶囊中延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素（内参物）、甘草苷、甘草酸铵含量的一测多评法，以期为评价制剂质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu LC-2030C 3D 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；XS105 DualRange 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；PRD-S-Q277 型超声波清洗器（杭州超声波有限公司，功率为600 W，频率为42 kHz）。

1.2 试药

延胡索乙素对照品（批号为110726-202020，含量为99.3%），盐酸巴马汀对照品（批号为110732-201913，含量为85.7%），咖啡酸对照品（批号为110885-201703，含量为99.7%），木犀草素对照品（批号为111520-202107，含量为96.3%），甘草苷对照品（批号为111610-202209，含量为95.2%），甘草酸铵对照品（批号为110731-202122，含量为94.4%），α-香附酮对照品（批号为110748-202117，含量为99.8%），均购自中国食品药品检定研究院；蒲元和胃胶囊（市售，规格为每粒0.25 g，批号分别为20210903，20220201，20220601）；乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min 时10%A，10～35 min 时10%A →25%A，35～45 min 时25%A →40%A，45～75 min 时40%A →95%A，75～80 min 时95%A →10%A，80～85 min 时10%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：237 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

取延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵对照品各适量，精密称定，分别加甲醇制成质量浓度为1.334 1，0.446 0，0.678 5，0.766 5，1.001 2，1.502 0，4.256 1 mg/mL 的对照品贮备液；取上述对照品贮备液各1 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制成质量浓度分别为26.68，8.92，13.57，15.33，20.02，30.04，85.12 µg/mL 的混合对照品溶液。

取20 粒样品内容物，混匀，取3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为600 W，频率为42 kHz）40 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，滤过，即得供试品溶液。

按样品处方工艺分别制备缺延胡索、香附、蒲公英和甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，分别按2.1 项下色谱条件进样测定。结果各成分的色谱峰分离度均大于1.5，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.咖啡酸 2.甘草苷 3.延胡索乙素 4.盐酸巴马汀 5.木犀草素 6.甘草酸铵 7.α-香附酮A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C-F.阴性对照品溶液（分别为缺延胡索、香附、蒲公英、甘草）Fig.1 HPLC chromatograms1.Caffeic acid 2.Liquiritin 3.Tetrahydropalmatine 4.Palmatine hydrochloride 5.Luteolin 6.Ammonium glycyrrhizinate 7.α-CyperoneA.Mixed reference solution B.Test solution C-F.Negative reference solution（lacking Corydalis Rhizoma，Cyperi Rhizoma，Taraxaci Herba，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，respectively）

线性关系考察：精密吸取2.2 项下延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵对照品贮备液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL，分别置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，按2.1项下色谱条件进样测定，以各成分质量浓度为横坐标（X，µg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果见表1。

表1 7种成分线性关系考察结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation of seven components（n=6）

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵峰面积的RSD分别为1.35%，0.77%，0.92%，1.65%，0.88%，0.52%，1.03%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号20210903）6 份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积，并计算含量。结果延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵含量的RSD分别为0.99%，0.91%，1.83%，0.76%，1.25%，1.37%，1.05%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液适量，分别于0，4，8，12，16，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.27%，0.55%，0.92%，1.36%，0.34%，1.19%，1.30%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量（延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵的含量分别为每粒50.47，31.00，15.74，20.50，67.60，112.47，362.83 µg，批号为20210903）的样品9 份，研细，每份1.5 g，精密称定，分别加入新配制的混合对照品溶液（延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵质量浓度分别为0.153 5，0.106 2，0.051 6，0.063 5，0.210 2，0.353 0，1.028 8 mg/mL）1.0，2.0，3.0 mL，各3 份，按2.2 项下制备供试品溶液法，按2.1 项下色谱条件连续进样测定。结果延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵的平均回收率分别为99.09%，97.34%，97.42%，96.85%，98.60%，99.20%，99.09%，RSD分别为0.72%，1.68%，1.75%，1.29%，0.69%，0.79%，0.97%（n=9），表明结果准确度良好。

2.4 相对校正因子建立

相对校正因子：精密吸取线性关系考察项下系列质量浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。以木犀草素为内参物，按公式fk/s=（Wk×As）/（Ws×Ak）计算相对校正因子。式中，As为内参物峰面积，Ws为内参物浓度，Ak为待测成分峰面积，Wk为待测成分质量浓度。计算延胡索乙素（Y）、盐酸巴马汀（B）、α-香附酮（X）、咖啡酸（K）、甘草苷（GG）、甘草酸铵（GA）、木犀草素（M）的相对校正因子，结果见表2。

表2 6种成分的相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of six components

相对校正因子耐用性考察：取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，分别考察不同型号高效液相色谱仪（Agilent 1260 InfinityⅡ型、Shimadzu LC-2030C 3D 型）、不同型号色谱柱（Diamonsil C18柱、Welch Ultimate XB-C18柱、Zafex JX-C18柱，规格均为250 mm × 4.6 mm，5 µm）、不同流速（0.9，1.0，1.1 mL/min）和不同柱温（25，30，35 ℃）对相对校正因子的影响。结果见表3，表明不同色谱条件下延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、甘草苷、甘草酸铵的相对校正因子无显著影响。

表3 不同色谱条件下各成分的相对校正因子Tab.3 Relative correction factor of each component under different conditions

2.5 待测成分色谱峰定位

取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，采用相对保留时间（RRT）法对各成分色谱峰进行定位，以木犀草素为内参物，分别按公式RRT=RTk/RTs计算延胡索乙素（Y）、盐酸巴马汀（B）、α-香附酮（X）、咖啡酸（K）、甘草苷（GG）、甘草酸铵（GA）的RRT。式中，RTs为内参物保留时间，RTk为待测成分保留时间。结果见表4，表明不同条件下各成分RRT无显著差异。

表4 不同色谱条件下各成分的相对保留时间Tab.4 Relative retention time of each component under different conditions

2.6 一测多评法与外标法测定含量

取3批（批号分别为20210903，20220201，20220601）样品各适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵的峰面积，按一测多评法和外标法分别计算各成分的含量。结果相对误差（RE）的绝对值均小于2.0%，表明2种方法的含量计算结果无显著差异。详见表5。

表5 3批样品一测多评法与外标法测定结果比较（µg/粒）Tab.5 Comparison of the results of three batches determined by ESM and QAMS（µg/ capsule）

3 讨论

3.1 指标性成分与内参物选择

蒲元和胃胶囊组方中，延胡索活血散瘀、镇静止痛，香附调经止痛、疏肝解郁，蒲公英清热解毒、消肿散结，甘草补脾益气、清热解毒、祛痰止咳［7-14］。分别选取4 味药材中主要活性成分延胡索乙素、盐酸巴马汀（延胡索）、α-香附酮（香附）、咖啡酸、木犀草素（蒲公英）、甘草苷、甘草酸铵（甘草）为定量分析的指标性成分，以全面反映制剂的内在质量。木犀草素对照品性质稳定、廉价易得，色谱峰峰形良好，附近干扰成分少，符合内参物的选择要求［5，15-16］，故选择木犀草素作为内参物。

3.2 供试品溶液处理方法选择

分别考察不同提取溶液（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇溶液）、不同提取方式（超声提取、回流提取）、不同提取时间（20，30，40，50 min）对延胡索乙素、盐酸巴马汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸铵提取效率的影响，发现甲醇超声提取对各成分的综合提取效率高，且操作方便，提取40 min 和50 min 时的效果差异不大。因此，选择甲醇超声提取40 min。

3.3 色谱条件选择

考察以甲醇-水、乙腈-水为流动相时，色谱峰拖尾严重，加入磷酸后可明显改善峰形，乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱对7 种成分的分离效果最佳。考察了237，254，280，323，350 nm波长处的响应值，结果237 nm波长处可兼顾7种成分，故选择237 nm为检测波长。

3.4 方法评价

本研究中建立的一测多评法操作简便、重复性好、结果准确可靠，可同时测定蒲元和胃胶囊中7种成分的含量，且测定结果与外标法测定结果无显著差异。