一测多评法同时测定半枝莲配方颗粒中5 种黄酮类成分含量*

钟华青，宋 辉，张 盛，胡云飞

（1.皖南医学院附属铜陵医院·安徽省铜陵市立医院，安徽 铜陵 244000；2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；3.亳州学院，安徽 亳州 236800；4.天津中医药大学，天津 301600）

半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲ScutellariabarbataD.Don 的干燥全草［1］，味辛、苦，性寒，主要归肺经，具有清热解毒、化瘀、利尿功效［2-3］，含有黄酮类、二萜类、多糖类、挥发油类等化学成分。现代药理学研究显示，半枝莲具有多种药理学活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节、抗阿尔茨海默病等，主要活性物质为黄酮类成分［4-8］。半枝莲配方颗粒为在饮片基础上制备的中药配方颗粒，质量控制包括野黄芩苷的含量［9］，限制了半枝莲整体质量评价的规范化，且半枝莲药材品质易受产地、采收期、种植方式等多种因素影响［10］。单一成分难以全面评价中药质量的优劣，通过多指标同步质量控制反映中药质量已成为当前中药质量评价领域的共识。一测多评（QAMS）法是通过测定一种成分，达到多成分同步定量的质量评价模式［11］，可解决外标法对照品难以得到或不稳定、使用量大、检验成本高的不足，实现了多种成分同时定量测定，适合中药质量评价检测特点。本研究中以野黄芩苷为内参物，建立了同时测定半枝莲配方颗粒中黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素含量的QAMS法，为进一步提高半枝莲配方颗粒整体质量提供科学依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 型液相色谱仪（美国Agilent 公司）；BT25S 型电子天平（精度为0.01 mg），BSA224S-CW 型电子天平（精度为0.1 mg），均购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Elma S120H 型超声仪（德国Elma 公司，功率为200 W，频率为37 kHz）；UPT-Ⅱ-10T型优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司）。

1.2 试药

野黄芩苷对照品（批号为110842-202010，含量为91.5%），黄芩苷对照品（批号为110715-202223，含量为97.2%），芹菜素对照品（批号为111901-202205，含量为98.4%），均购自中国食品药品检定研究院；野黄芩素对照品（批号为20021501，纯度大于98.0%），柚皮素对照品（批号为20022406，纯度大于98.0%），均购自上海纯优生物科技有限公司；甲醇和甲酸均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水；半枝莲配方颗粒（广东一方制药有限公司，规格为每包3.75 g，相当于常规饮片15 g，批号分别为20092183，21082273，19072343，21052233，19031893，21007283，21010543，21010301，20070993，编号为S1-S9）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲酸水溶液（pH 2.5）-甲醇（65∶35，V/V）；流速：0.8 mL/ min；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

分别取野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、柚皮素、芹菜素对照品各适量，精密称定，加80%甲醇溶解，制备成上述5 种成分质量浓度分别为3.602，0.405，0.810，0.201，0.093 mg/ mL 的混合对照品贮备液；取各对照品贮备液125 µL，加80% 甲醇稀释至4 mL，作为混合对照品溶液。取野黄芩苷对照品5.00 mg，精密称定，置5 mL 容量瓶中，加80%甲醇定容，摇匀，作为野黄芩苷对照品溶液。取样品1.5 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定质量，超声30 min，放冷，再次称定质量，加80%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45µm 滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。按半枝莲配方颗粒处方比例称取辅料，按生产工艺制备无半枝莲的阴性配方颗粒，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2项下供试品溶液、混合对照品溶液和阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。黄芩苷、野黄芩素、柚皮素、芹菜素和野黄芩苷色谱峰均达到基线分离，各相邻化合物的色谱峰分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000，分离度良好，且阴性对照品溶液对测定无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.野黄芩苷 2.黄芩苷 3.野黄芩素 4.柚皮素 5.芹菜素A.供试品溶液 B.混合对照品溶液 C.阴性对照品溶液Fig.1 HPLC chromatograms1.Scutellarin 2.Baicalin 3.Scutellarein 4.Naringin 5.ApigeninA.Test solution B.Mixed reference solution C.Negative reference solution

线性关系考察：精密吸取2.2项下对照品贮备液适量，等倍稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，分别以各化合物的质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系考察结果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素峰面积的RSD分别为1.14%，1.58%，0.91%，1.25%，2.97%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20092183）1.5 g，精密称定，共6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素峰面积的RSD分别为0.89%，1.03%，0.75%，0.81%，1.57%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，4，8，12，18，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素峰面积的RSD分别为1.25%，1.29%，1.50%，2.08%，1.46%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h 内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20092183）0.75 g，精密称定，共6 份，分别精密加入混合对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素的平均加样回收率分别为95.33%，97.44%，96.78%，100.59%，96.01%，RSD分别为1.35%，1.79%，1.67%，2.86%，1.79%（n=6）。

2.4 色谱峰定位确定

色谱峰定位：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液5，10，15 µL，按2.1 项下色谱条件进样测定3 次，以野黄芩苷为内标，测定黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素的相对保留时间（RRT），取平均值。结果上述4 种黄酮类化合物相对于野黄芩苷的RRT 分别为1.369，1.423，1.526，1.773，RSD分别为0.90%，0.68%，0.72%，0.48%（n=9），均小于2.00%，表明各化合物的RRT相对稳定。结果见表2。

表2 黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素（以野黄芩苷为内标）的相对保留时间Tab.2 Relative retention time of baicalin，scutellarein，naringin，and apigenin（with scutellarin as the internal standard）

色谱峰定位的重复性：取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，分别考察不同型号液相色谱仪（Agilent 1290 型、Waters 2695 型、Thermo Ultimate 3000 型）及色谱柱［Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm），Waters XBridge C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 µm），Thermo Hypersil GOLD柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）］对黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素色谱峰定位的影响。结果上述4种黄酮类化合物相对于野黄芩苷的RRT 分别为1.371，1.424，1.528，1.775，RSD分别为1.02%，0.80%，0.79%，0.93%（n=9），均小于2.00%，表明各化合物的色谱峰定位具有良好的重复性。结果见表3。

表3 不同高效液相色谱仪和色谱柱下黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素（以野黄芩苷为内标）的相对保留时间Tab.3 Relative retention time of baicalin，scutellarein，naringin，and apigenin（with scutellarin as internal standard）by different HPLC instruments and chromatographic columns

2.5 相对校正因子（RCF）确定

RCF 计算方法：分别精密吸取2.2 项下混合对照品溶液5，10，15 µL，按2.1 项下色谱条件进样测定3 次，以野黄芩苷为内标，测定黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素峰面积的RCF，取平均值。校正因子计算公式为RCF=（Cs×Ak）／（Ck×As）。式中，Cs为参照物野黄芩苷的质量浓度，As为参照物的色谱峰峰面积，Ck和Ak分别为黄芩苷、野黄芩素、柚皮素、芹菜素的质量浓度和峰面积。结果黄芩苷、野黄芩素、柚皮素、芹菜素相对于野黄芩苷的RCF 分别为0.671，0.787，0.826，0.516，RSD分别为2.36%，1.84%，1.33%，2.05%（n=9），均小于2.00%，表明RCF相对稳定。结果见表4。

表4 黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素（以野黄芩苷为内标）的相对校正因子Tab.4 RCF of baicalin，scutellarein，naringin and apigenin to（with scutellarin as internal standard）

RCF 的重复性考察：取2.2 项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，分别考察不同型号液相色谱仪（Agilent 1290 型、Waters 2695 型、Thermo Ultimate 3000 型）及色谱柱［Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）、Waters XBridge C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 µm）、Thermo Hypersil GOLD 柱（250 mm ×4.6 mm，5µm）］对黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素RCF 的影响。结果上述4种黄酮化合物相对于野黄芩苷的RCF 分别为0.672，0.778，0.823，0.518，RSD分别为2.47%，2.58%，1.80%，2.27%（n=9），均小于3.00%，表明各化合物的RCF 在不同高效液相色谱仪与不同色谱柱下重复性良好。结果见表5。

表5 不同高效液相仪和不同色谱柱下黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素（以野黄芩苷为内标）的相对校正因子Tab.5 RCF of baicalin，scutellarein，naringin and apigenin（with scutellarin as internal standard）by different HPLC instruments and chromatographic columns

2.6 样品测定与验证

取9 批样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，分别采用外标法和QAMS法测定样品中黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素的含量。结果2 种方法的测量结果的相对偏差均不超过2.20%，上述4 种黄酮类化合物的平均相对偏差分别为1.48%，1.08%，1.17%，1.19%（n=9），均小于2.00%，表明QAMS 法测定半枝莲配方颗粒中上述4 种黄酮类化合物的结果准确可靠，方法可行。结果见表6。

表6 半枝莲配方颗粒中黄芩苷、野黄芩素、柚皮素、芹菜素的一测多评法与外标法含量测定结果比较Tab.6 Results of the content determination of baicalin，scutellarein，naringin and apigenin in Banzhilian Formula Granules by the QAMS method and the external standard method

3 讨论

目前，国家颁布近200 种中药配方颗粒的质量标准，但中药配方颗粒的质量和标准问题仍面临巨大挑战［12-14］。杨敏娟等［15］建立了半枝莲药材的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，并对不同产地的半枝莲药材质量进行了评价。王治阳等［16］采用高效液相色谱（HPLC）法测定不同产地半枝莲药材中8种黄酮类成分的含量。YANG 等［17］通过液相色谱-质谱（LC-MS）法测定半枝莲药材中芹菜素、黄芩素、黄芩苷、木犀草素、柚皮素和汉黄芩素6 种黄酮类成分的含量。王秀芹等［18］进行了半枝莲配方颗粒质量标准的研究，建立了HPLC 指纹图谱，但仅测定了野黄芩苷的含量。

目前，已分离鉴定出半枝莲的70 余种黄酮类化合物，包括黄酮、黄烷酮、黄酮苷、查尔酮4类，其中以黄酮类及其苷类成分居多［19］。野黄芩苷是半枝莲中含量最高的黄酮类化合物，其次为黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素［20］。因此，本研究中采用QAMS 法测定半枝莲配方颗粒中5种黄酮类化合物的含量，以期更全面地控制半枝莲中活性成分的含量。

流动相曾考察甲醇-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液和甲醇-乙酸水溶液，结果甲醇-甲酸水溶液（pH 2.5）作为流动相时基线比较平稳，峰形及分离度较好，故以此溶剂作为流动相。采用二极管阵列检测器（DAD）于250～400 nm 波长范围内对5 种指标性成分进行扫描，结果野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素、柚皮素、芹菜素的最大吸收波长分别为335，280，276，370，340 nm，故考察了5 个检测波长对半枝莲配方颗粒供试品溶液的紫外吸收情况。结果显示，目标物于280 nm 波长处响应最好，故选择280 nm 作为检测波长。此外，考察不同流速和不同柱温对色谱峰的影响，结果在流速0.8 mL/min、柱温30 ℃条件下出峰个数较多，色谱峰的分离度和峰形均较好，峰面积较大。故选择0.8 mL/min和30 ℃作为流速和柱温。

综上所述，本研究中建立的方法结果准确、耐用性较好，较外标法成本低、操作简便，适用于半枝莲配方颗粒中黄芩苷、野黄芩素、柚皮素和芹菜素的含量测定。