《中医方剂大辞典》含柴胡防疫组方规律分析及核心药对治疗新型冠状病毒肺炎作用机制研究*

汪 彬，李伟霞，，王晓艳，吴娅丽，张 辉，贾金浩，韩 冰，纪秋如，陈小菲，唐进法，△

（1.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院·河南省中药临床应用、评价与转化工程研究中心·河南省中药临床药学中医药重点实验室·河南省中药安全评价与风险防控工程研究中心，河南 郑州 450046；3.河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046）

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已成为全球关注的公共卫生事件［1-2］。我国发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》提出，COVID-19 属中医“疫病”范畴［3］。柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，始载于《神农本草经》，有和解表里、退热截疟功效，能有效治疗COVID-19 初期发热、干咳、乏力的症状，具有解热、镇痛、抗炎等作用［4-5］。《中医方剂大辞典》是一部纳入国家中医药管理局科研课题的方剂学大型工具书，具有全面、准确、易检、实用等特点［6］。本研究中以《中医方剂大辞典》为数据来源，运用关联规则分析、聚类分析等数据挖掘技术［7］，深度挖掘其相关药物配伍规律，结合网络药理学构建成分-靶标-通路网络，预测柴胡-黄芩治疗COVID-19 的潜在作用靶点及作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 数据挖掘

1.1.1 纳入与排除标准

纳入标准：明确含柴胡治疗与疫病相关的方剂（不计临证加减药物）；所载方药有明确的药物组成，剂量清楚，且疗效明确。

排除标准：药物组成相同而方名不同的方剂按重复方剂计，药物组成不同而方名相同的方剂按不同方剂累计；主治病证不明确，《中医方剂大辞典：第十一册》病证索引中无法检索。

1.1.2 数据规范化

录入中药以2015 年版《中国药典（一部）》为标准，并参考全国高等中医药院校“十三五”规划教材《中药学》《中药大辞典》《中华本草》进行药名规范。同种药物不以地域、炮制方法、别称区分，均记录为同种药物，如将北柴胡、银柴胡规范为柴胡，炒白术规范为白术，官桂、桂心、桂皮规范为肉桂。

1.1.3 数据统计与分析

采用SPSS Modeler 18.0 软件对符合纳入标准的中药进行用药频率、性味归经等描述性分析，通过Apriori建模进行关联规则分析［8］。采用SPSS Statistics 25.0 软件，利用组间联接的方法进行系统聚类分析［9-11］。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 核心药对柴胡-黄芩与COVID-19 靶点筛选

共筛选到含柴胡的方剂442 首。选用核心药对柴胡-黄芩进行网络药理学分析。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：// tcmsp-e.com/）收集柴胡、黄芩有关成分，采用Swiss TargetPrediction 在线靶点筛选平台（http：// swisstargetprediction.ch/）筛选靶标，整合数据并去重。在MalaCards 数据库（https：//www.malacards.org/ ）、TTD 数据库（https：// db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）中，分别以“COVID-19”为关键词搜索相关靶标，去重后获得共有靶标。

1.2.2 数据统计与分析

将共有靶标输入String数据库（https：//string-db.org/），去除游离蛋白，获得蛋白质交互作用（PPI）网络图，导入Cytoscape 3.9.0 软件进行网络构建与分析，并计算Hub 基因。将共有靶标导入Omishare 平台（https：//www.omicshare.com/ tools/）中的基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集高级分析工具模块进行可视化分析，采用Cytoscape 3.9.0 软件对关键通路进行成分-靶标-通路网络构建［12］。

2 结果

2.1 含柴胡防疫方剂高频用药的频次

442 首含柴胡防疫方剂涉及334 味中药，用药频次共4 877次。其中，高频药物（频次≥60次）20味，累计用药频次2 658 次，详见图1。在20 味高频药物中，与柴胡配伍使用最多的为甘草，其次为黄芩和半夏。

图1 含柴胡防疫方剂用药频次分布（频次≥60）Fig.1 Distribution of medication frequency of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix（frequency ≥60 times）

2.2 含柴胡防疫方剂高频用药的四气五味

高频用药的药性包括温、平、寒3 种，占比最高的为温性药物，有白术、半夏、桂枝、人参等；其次为寒性药物和平性药物。高频用药药味包括苦、甘、辛、酸、咸5 种，占比最高的为苦味药物，有柴胡、白术、槟榔、黄芩等；其次为甘味药物和辛味药物。详见表1和图2。

表1 含柴胡防疫方剂高频用药（频次≥60次）性味分布Tab.1 Distribution of medicinal natures and flavors of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）

图2 含柴胡防疫方剂高频药物（频次≥60次）性味频次分布雷达图A.药性 B.药味Fig.2 Radar chart of frequency distribution of natures and flavours of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）A.Medicinal natures B.Medicinal flavors

2.3 含柴胡防疫方剂高频用药功效频次

补气药和理气药占比最高，其次为清热泻火药、补血药和发散风寒药。补气药包括甘草、人参等，理气药包括青皮、槟榔等，清热泻火药包括黄芩、知母等；发散风寒药包括桂枝、柴胡等；补血药包括当归、川芎等。详见表2。

表2 含柴胡防疫方剂高频用药（频次≥60次）功效分布（n=20）Tab.2 Distribution of efficacy of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times，n=20）

2.4 基于关联规则Apriori 算法组方规律分析

采用IBM SPSS Modeler 18.0 软件对高频药物采用Apriori 算法，设置最低支持度（C）为30%，最小规则置信度（S）为80%，最大前项数为3，提升度≥1.0，共得到135 条关联规则。关联规则网络中，药物连线越粗，二者间的关联度越大；反之，关联度越小。柴胡与补益药、清热药、燥湿化痰药合用时，配伍使用频率最高的有甘草、黄芩、半夏、人参、茯苓、陈皮。详见表3和图3。

表3 含柴胡防疫方剂高频药物（频次≥60次）关联规则表Tab.3 Association rules of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）

图3 含柴胡防疫方剂高频药物（频次≥60次）关联规则网络Fig.3 Association rule network of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）

2.5 含柴胡防疫方剂高频用药聚类分析

采用IBM SPSS Statistics 25.0 软件对前20 味高频用药进行系统聚类分析，设置类型为水平谱系图，聚类方法为瓦尔德法，区间选择平方欧氏距离，共得到5 组多味药物组合和2 组药对。详见图4。其中，C1（药对）：柴胡、甘草；C2（多味药物组合）：黄芩、陈皮、半夏；C3（多味药物组合）：茯苓、白术、人参；C4（药对）：当归、白芍；C5（多味药物组合）：鳖甲、桂枝、知母；C6（多味药物组合）：川芎、地黄、枳壳；C7（多味药物组合）：常山、槟榔、青皮、厚朴。C1-C3 为治疗COVID-19 的“三药三方”清肺排毒汤主要药物；C4 为常用养血药对，养血调肝、健脾利湿；C5为知母鳖甲汤主要药物，养阴清热，化痰截疟；C6 为血府逐瘀丸组方药物，疏肝理气、活血散结；C7为达原饮主要组方药物，可用于瘟疫初期和疟疾的治疗。可见，7组聚类总体为扶正祛邪组合。扶正以活血化瘀、调理气血为主，祛邪以清肺排毒、清热利湿、化痰截疟为主，体现了中医基于湿、热、毒、瘀病机治疗疫病。

图4 含柴胡防疫方剂高频药物（频次≥60次）聚类分析谱系图Fig.4 Cluster analysis of anti-epidemic prescriptions containing Bupleuri Radix with high frequency（frequency ≥60 times）

2.6 筛选柴胡-黄芩核心药对

柴胡-甘草关联度最高，甘草多作为使药，发挥调和诸药、缓解药物毒性等协同作用。黄芩多作为臣药，苦能燥湿、泄热下气，寒能清热解毒；入胆则清少阳邪热，入脾、大肠则燥肠胃湿热，为清热燥湿、泻火解毒常用之品。柴胡-黄芩的关联度仅次于柴胡-甘草，故选用柴胡-黄芩药对进行网络药理学进行深度分析。柴胡-黄芩是临床常用方剂小柴胡汤的主要成分，也是仲景柴胡系列方剂中最具代表性的基本配伍。“三药三方”中清肺排毒方的组成也是小柴胡汤［13-14］，但治疗COVID-19的作用机制尚不明确。

2.7 柴胡-黄芩药对网络药理学分析

COVID-19 疾病靶点筛选：通过GeneCards，Disgenet，TTD 数据库检索COVID-19，并通过相关度大于中位数规则进行筛选，共得到疾病靶点473 个。疾病靶点与成分靶点相交，得共有靶标80个。详见图5。

图5 柴胡-黄芩核心药对成分与COVID-19共有靶标维恩图Fig.5 Venn diagram of the intersection targets of core components of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix drug pair and the COVID-19

柴胡-黄芩药对活性成分筛选：通过TCMSP 数据库检索柴胡-黄芩有效成分及基因靶点，通过Swiss Target Prediction数据库进行预测，最终筛选出主要活性成分柴胡12个，黄芩31个，柴胡-黄芩的共同有效成分为豆甾醇（stigmasterol），去除重复靶点，共得到553 个靶点。主要活性成分信息见表4。

表4 柴胡-黄芩的共同活性成分Tab.4 Common active ingredients of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix

柴胡-黄芩药对PPI 网络图构建：在完整的PPI 网络中，度值（degree）越大的靶标，可连接的节点越多，提示该靶在生物信号通路中可能为上游基因，在信号通路的传导过程中起到关键枢纽作用，详见图6。采用Cytoscape 3.9.0 软件内CytoHubba 插件中度值算法筛选得到交互作用，提示评分在前10的基因可能是柴胡-黄芩在治疗COVID-19 中发挥重要作用［15］。其中，较重要的靶标主要有表皮生长因子受体（EGFR）、信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）、丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白细胞介素2（IL-2）等。详见图7。

图6 柴胡-黄芩治疗COVID-19的PPI网络Fig.6 PPI network of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

图7 柴胡-黄芩治疗COVID-19的Hub基因Fig.7 Hub gene of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

2.8 GO 分析与KEGG 富集分析

通过Omishare平台（https：//www.omicshare.com/）中GO 及KEGG 富集工具进行富集分析发现GO 分析3 736个相关条目。结果显示，在生物调节、细胞代谢、免疫调节、生物附黏等生物功能，抗氧化活性、调节细胞活性、炎性反应等分子功能有广泛的调节作用，详见图8。KEGG 富集分析共获得230 条信号通路，通过中国知网（https：// www.cnki.net/）、PubMed（https：// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）文献数据库检索剔出P值较小排名靠前的假阳性通路，筛选出与COVID-19 疾病强相关的20 条核心通路，并绘制KEGG 富集分析气泡图，详见图9。结果显示，主要涉及的信号通路有EGFR信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、辅助性T 细胞17（TH17）信号通路、Janus 蛋白酪氨酸激酶（Jak）-STAT 信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、磷脂酰肌醇3激酶-AKT（PI3K-AKT）信号通路、核因子-κB（NF-κB）信号通路等。

图8 柴胡-黄芩治疗COVID-19的GO分析条形图Fig.8 GO analysis bar chart of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

图9 柴胡-黄芩治疗COVID-19的KEGG富集分析气泡图Fig.9 KEGG enrichment analysis bubble chart of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

2.9 成分-靶标-通路网络构建

将所得到的化合物、作用靶标和KEGG通路信息导入Cytoscape 3.9.0 软件，构建成分-靶标-通路网络，包括95 个节点、445 条边，详见图10。活性成分山柰酚（CH005）、黄芩素（HQ021）、小檗碱（HQ019）、汉黄芩素（HQ030）、刺槐素（HQ022）等度值靠前，可连接多个靶标，提示在网络中的贡献度很高，可能在治疗COVID-19疾病中起到了关键作用；主要共有靶标有37 个，其中EGFR，STAT3，AKT1，IL-2 等度值靠前，可连接多个活性成分，提示该靶标可被多个成分共同调节。

图10 柴胡-黄芩治疗COVID-19的成分-靶标-通路网络Fig.10 Component-target-pathway network of Bupleuri Radix-Scutellariae Radix in the treatment of COVID-19

3 讨论

防疫方剂中用药频次最高的前20味中药包括柴胡、甘草、黄芩、桂枝、半夏、茯苓、白术等，与防疫“三药三方”中的清肺排毒方主要成分基本一致，适用于COVID-19初期轻症患者［16］。配伍知母、鳖甲等滋阴清热药，人参、川芎、当归补气血药，甘草发挥调、补、缓作用，能有效缓解COVID-19患者的阴液耗竭、肺火上炎、气血亏虚症状。从中药性味分析，温性药与寒性药分别占43.55%和38.73%，表明方剂多以温阳助阳、寒以清热、寒温并用之法治疗疫病，符合中医药“正气存内，邪不可干”的思想；苦、甘、辛分别占41.78%，26.36%，23.73%，苦能清热燥湿、泻火解毒，甘能缓急和中、调和诸药，辛可发散解表、化痰散结。从中药功效分类来看，柴胡与补气药、理气药、清热泻火药、补血药、发散风寒药等配伍，解表散邪外兼补气，伤邪固正。

在关联规则分析中，柴胡-甘草、柴胡-黄芩和柴胡-甘草-黄芩均具有较高的支持度。柴胡-黄芩是中医临床的常见药对，具有消减郁热、清热燥湿、调和表里、和解少阳的功效；柴胡-甘草可疏肝理气，健脾和中。三者为柴胡黄芩甘草汤主要组成部分，是治疗少阳本证的经典方剂。与核心药对柴胡-黄芩、甘草组合的大枣、生姜、半夏也是小柴胡汤的主要成分。小柴胡汤是和解剂，具有和解少阳的功效，临床主要用于治疗伤寒少阳病证［17］。针对不同病证，柴胡有不同配伍，常配伍甘草、黄芩、人参、半夏，反映柴胡治疗不同疾病时的用药规律和配伍特点，符合中医在诊疗中“异病同治”的基本思想及“扶正祛邪”的指导原则。

聚类分析共得到7类，其中C1-C3为治疗COVID-19的“三药三方”小柴胡汤加减，化湿理气、调畅气机，可改善肺气壅滞、胸闷急促、气机不畅、痰饮内聚等症［18］。少阳乃是太阳、阳明升降的枢纽，可调节三阳经气升降［18-19］。COVID-19 之寒湿疫毒郁于膜原，致少阳枢机不利。小柴胡汤具有两解少阳、太阳之邪的作用，配以白术、茯苓、陈皮，理气健脾、燥湿化痰。C4 为常用养血药对，养血调肝，健脾利湿，可明显改善气血亏虚、痰饮内停之症。C5-C7 为知母鳖甲汤、血府逐瘀丸、达原饮主要组方药物，可养阴清热、化痰截疟、疏肝理气，活血散结，对COVID-19、瘟疫初期和疟疾具有良好效果［20］。

本研究中基于网络药理学研究《中医方剂大辞典》含柴胡防疫方中核心药对柴胡-黄芩治疗COVID-19的作用机制，得到柴胡-黄芩治疗COVID-19 的潜在活性成分为山柰酚、黄芩素、小檗碱、汉黄芩素、刺槐素、苏荠苧黄酮、黄芩苷、5，7，4'-三羟基-8-甲氧基黄酮、红花素、谷甾醇等。其中，山柰酚、黄芩素、小檗碱等均为黄酮类成分，具于抗炎、抗病毒、抗感染、免疫调节作用［21-22］。SUN 等［23］的研究发现，山柰酚减少了脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞对炎性因子的分泌，体外抑制MAPK/NF-κB 信号传导，调节巨噬细胞极化为M2型，抑制内毒素诱导的细胞因子风暴，提高小鼠的存活率；严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）蛋白酶（3CLpro）在冠状病毒中表现出高度保存性，是治疗COVID-19的关键靶标。研究表明，黄芩素对3CLpro具有较强的活性抑制作用［24］；汉黄芩素可通过增加免疫细胞的浸润、调节免疫细胞的表型来增强免疫功能［25］，保护肺功能；小檗碱可抑制血清γ 干扰素（IFN-γ）及肺部IFN-γ，IL-10，CCL25 过度产生，对流感病毒感染导致的小鼠肺损伤起保护作用［26］。张英睿等［27］通过网络药理学与分子对接技术发现，刺槐素等可通过作用于胱天蛋白酶3（CASP3）、胱天蛋白酶8（CASP8）、人细胞凋亡因子配体（FASLG）等靶点调节细胞凋亡通路及TNF 通路，从而实现对COVID-19 的潜在治疗作用。

结合交集靶标绘制的PPI网络及评分，得到度值排前10 的Hub 基因，分别为EGFR，STAT1，STAT3，JAK1，JAK2，MAPK1，IL-2，AKT1 及热休克蛋白90a 型1（HSP90AA1）、非受体型蛋白酷氨酸磷酸酶11（PTPN11）。其中，STAT1和STAT3参与冠状病毒感染期间炎性反应的诱导，通过影响Th17 和B 细胞介导的功能来抑制抗病毒干扰素反应，并诱导不平衡的抗病毒适应性免疫应答［28］；JAK1 和JAK2 是参与免疫的细胞因子，抑制二者可减少COVID-19 相关的细胞因子风暴；MAPK 和AKT1 主要参与细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程［29］；HSP90AA1 和IL-2 可发挥抗炎作用，指导COVID-19患者的病情进展、治疗及预后的评估等过程［30］。基于网络药理学和中医理论分析柴胡-黄芩通过上述靶点调节炎性反应过程和人体免疫功能，可达到扶正祛邪的目的。

GO 分析表明，生物过程占比最大，主要为细胞代谢过程的调节、刺激反应的正向调节、多细胞生物过程、生物黏附、细胞死亡等；分子功能主要为转录因子活性、蛋白质结合、抗氧化活性。KEGG 富集分析主要包括EGFR 信号通路、TNF 信号通路、NF-κB 信号通路等。COVID-19 通过促进肺上皮细胞EGFR 表达的增加，触发炎性反应［31］。通过抑制EGFR，阻断与IL-6 的联系，降低炎性反应即静脉血栓形成，降低COVID-19重症病死率［32］。TNF-α是急性和慢性全身炎性反应的主要多效性介质，可同时调节细胞的凋亡和增殖，促进其他趋化因子和细胞因子的产生［33-34］。SARS-CoV-2感染期间，侵袭性炎性反应和细胞因子风暴会导致严重的全身组织损伤和死亡，而TNF 信号通路在细胞因子释放综合征（CRS）中起至关重要的作用［35］。NF-κB信号通路在COVID-19的自然进展和转化为严重表型中发挥了重要作用，抑制NF-κB 信号通路可能是目前有效抗冠状病毒药物的作用机制［36］，激活NF-κB、抑制TNF-α 可能会导致细胞因子风暴的减少，缓解COVID-19的严重程度。

本研究中通过对《中医方剂大辞典》中含柴胡防疫方剂进行关联规则、聚类分析，深度挖掘柴胡治疗疫病的用药组方规律，明确了相关药物的用药频率及配伍规律。运用网络药理学的方法深度挖掘核心药对柴胡-黄芩治疗COVID-19 的潜在活性靶点及作用机制。柴胡-黄芩同一活性成分可调控不同靶点，而同一靶点可作用于不同的生物学过程及信号通路，体现多通路、多靶点联合作用的特点，为发掘柴胡的潜在作用机制和临床治疗思路提供了新方向。但本研究未对柴胡相关数据挖掘的药效成分、作用靶点及作用机制进行验证，有待后续深入研究。