蒙药经典方剂肉豆蔻-5 对心肌梗死的保护作用及机制研究*

张 瑶，付贺青，刘 晶，聂慧娟，董 玉，4，刘天龙△

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010030；3.内蒙古医科大学心血管疾病临床和基础研究重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010130；4.内蒙古自治区蒙药药效物质与质量控制工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010110）

心肌梗死（MI）是导致我国人口非正常死亡的主要原因［1］。在缺血条件下，心肌细胞发生死亡，心脏功能出现进行性降低，最终形成心力衰竭（简称心衰）［2］。虽然介入治疗能恢复缺血部位的血供，减少梗死面积和恢复心脏功能，但由于心肌细胞的不可再生性，介入治疗后的短期和长期不良预后风险显著增加［3］。心肌成纤维细胞在缺血条件下向肌成纤维细胞转化，发生表型转换的成纤维细胞的增殖属性显著增加，且表达大量的细胞因子，如转化生长因子（TGF）、基质金属蛋白酶（MMP）、胶原等，这些细胞因子在心肌纤维化的形成过程中发挥了重要作用［4-5］。在正常生理条件下，心肌细胞主要通过脂肪酸在线粒体中的氧化磷酸化合成腺苷三磷酸（ATP）以维持心脏的能量消耗；在缺血条件下，心脏的能量代谢模式发生转变，心肌细胞线粒体对脂肪酸的氧化磷酸化能力下降，而胞质中利用葡萄糖的糖酵解水平增加［6］。因此，调整心肌细胞病理条件下的代谢模式被视为治疗心肌疾病的有效方式［7］。蒙药在治疗心血管疾病方面表现出一定优势，广泛用于缺血性心肌病的治疗，且疗效显著。肉豆蔻-5 作为蒙医治疗心赫依病（缺血性心肌病）的经典名方，源于《蒙医药方汇编》，蒙语名“匝迪-5”，现收录于《中华人民共和国卫生部药品标准（蒙药分册）》。由于中草药化学成分和作用靶点复杂，肉豆蔻-5保护心肌缺血的分子机制尚不清楚。本研究中利用大鼠心肌蛋白质组学数据分析蒙药经典方剂肉豆蔻-5 保护MI 的作用机制，进一步开发该经典方剂的应用潜力。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：D6 LAB型小动物超声系统（飞依诺科技股份有限公司），配有小动物呼吸机；Multiskan FC 型酶标仪（美国Thermos 公司）；LV100NPOL/Ci-POL 型显微镜（日本Nikon公司）。

试药：肉豆蔻（批号为18112702），木香（批号为18090403），土木香（批号为170801），广枣（批号为190112），荜茇（批号为180901），均购于内蒙古天力药业有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（批号为A020-2），肌酸激酶脑型同工酶（CK-MB）检测试剂盒（批号为E006），均购自南京建成生物工程研究所；改良Masson三色染色液（上海源叶生物科技有限公司，批号为R20381）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，298-96-4），三溴乙醇（批号为T484020），均购自美国Sigma-Aldrich公司。

动物：SPF 级Wistar 雄性大鼠50 只，体质量220～250 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0010。饲养于内蒙古医科大学动物中心屏障系统内，在温度22～26 ℃、相对湿度40%～60%环境喂养。动物实验经内蒙古医科大学实验动物伦理委员会批准，所有操作均遵守《实验动物使用规范》。

1.2 方法

样品制备与给药剂量设置：按10∶8∶8∶5∶1（m/m/m/m/m）称取肉豆蔻、木香、土木香、广枣、荜茇，共20 kg，加95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，浓缩，蒸干，得95%有效部位；药渣再用50%乙醇回流提取2 次，每次2 h，趁热用棉花粗滤，合并滤液，滤液减压浓缩至无醇味，用蒸馏水定容；采用大孔吸附树脂柱洗脱，先用蒸馏水洗脱，再用50%乙醇洗脱，蒸干洗脱液，得50%有效部位。按有效部位提取率将供试品与0.5%羧甲基纤维素钠混合，制备混悬液。肉豆蔻-5 的临床用量为每70 kg体质量6 g，根据人和大鼠的体表面积计算用量，且大鼠的用量为人的6.3 倍，计算得大鼠的干预剂量为0.54 g/kg。故设置肉豆蔻-5 高、中、低干预剂量分别为0.27，0.54，1.08 g/kg。

分组与建模［8-9］：将50 只Wistar 雄性大鼠分为空白对照组（A 组），模型对照组（B 组），肉豆蔻-5高、中、低剂量干预组（C1组、C2组、C3组），各10 只。在复制MI模型前，C1组、C2组、C3组大鼠按预定剂量灌胃相应药物，预处理1周，A组和B组大鼠灌胃等量羧甲基纤维素钠。预处理结束后，B组、C1组、C2组、C3组大鼠行冠脉左前降支（LAD）结扎术，实验周期为4周。使用2.5%三溴乙醇麻醉大鼠，每100 g 体质量给药2 mL，麻醉后固定在自制的固定板上，行经口气管插管并连接小动物呼吸机，呼吸机潮气量设置为20 mL，呼吸频率设置为100 次/ 分，剃毛消毒后，在距离中位线1 cm 处纵向剪开大鼠左胸部皮肤，开口2 cm，在第二肋间行开胸手术，手术开口1.0 cm，使用自制开口器撑开切口，剪开心包膜暴露心脏，使用6-0 号尼龙线将冠脉LAD 进行永久性结扎，结扎完成后，逐层关胸，并滞留连接注射器直径1 mm 的无菌塑料管，缝合后，通过输液器将胸腔抽为负压，拔出滞留管。A 组大鼠与B 组、C1组、C2组、C3组大鼠行相同手术，但不结扎冠脉LAD。待大鼠苏醒并恢复自主呼吸后，拔除气管插管，放回饲养笼。

样本处理：实验结束后，麻醉大鼠，使用含抗凝剂的采血管行腹主动脉取血后处死大鼠，开胸，取出心脏，使用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗净心脏表面和心腔内的血液，剪掉心耳及其连带的主动脉。将心肌组织由上到下平均分为3 份，上、下端冻存于-80 ℃冰箱用于蛋白质组学检测，中段心肌组织使用4%多聚甲醛固定用于病理学检测。收集血液，离心（1 000g）10 min，分离血浆，用于心肌损伤标志物检测。

外周血心肌损伤标志物水平检测：利用LDH 试剂盒和CK-MB试剂盒检测大鼠外周血中LDH和CK-MB水平，评价大鼠心肌损伤水平。

心脏功能检测：MI 模型建模成功4 周后，通过体外超声测定左室射血分数（LVEF），评价心脏功能。

心肌组织TTC染色：实验结束后，处死大鼠，并分离心脏。将心脏置-80 ℃冰箱迅速冷冻15 min，取出，用手术刀将结扎位置以下部位切成厚度为0.5～1.0 mm的薄片，将薄片置1% TTC 染液中于37 ℃孵育30 min，4%（m/V）多聚甲醛溶液进行固定并拍照。采用Image J V2.3.0软件统计大鼠心肌梗死面积。

心肌组织Masson 染色：用4%多聚甲醛溶液对心肌组织进行固定，固定48 h 后将组织转移至包埋盒，流水冲洗2 h，依次置入70%乙醇25 min、80%乙醇25 min、90%乙醇30 min、95%乙醇Ⅰ30 min、95%乙醇Ⅱ20 min、100%乙醇Ⅰ10 min、100%乙醇Ⅱ10 min、二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、石蜡Ⅰ10 min、石蜡Ⅱ10 min、石蜡Ⅲ10 min，得可供切片的蜡块。石蜡切片厚度6µm，于乳头肌水平横切，经脱蜡、去除内源性过氧化物酶后，行Masson染色，评价大鼠心肌纤维化程度。

心肌组织蛋白质组学检测：基于高剂量肉豆蒄-5治疗MI 的效果最佳，本研究中选取了A 组、B 组、C1组各5个样本进行大鼠心肌组织蛋白质组学检测。由上海中科新生命生物科技有限公司负责完成，对蛋白质组学数据进行生物信息学分析，由本课题组自行完成。

1.3 统计学处理

采用Graphpad Prism 8.0软件V9.1.2分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对心脏功能与心肌损伤的保护作用

与A组比较，B组大鼠的LVEF显著降低（P＜0.001）；与B 组比较，C1组大鼠的LVEF 显著升高（P＜0.05）。详见图1 A'。与A 组比较，B 组大鼠外周血心肌损伤标志物LDH 和CK-MB 水平均显著升高（P＜0.001）；与B组比较，C1组、C2组大鼠外周血中LDH 和CK-MB 水平均显著降低（P＜0.05）。可见，肉豆蒄-5 对LDA 结扎诱导MI 模型大鼠的LDH 和CK-MB 水平升高有抑制作用。详见图1 B'和图1 C'。

图1 肉豆蔻-5对MI模型大鼠心脏功能与心肌损伤的保护作用（n=5）注：与A组比较，###P ＜0.001；与B组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。图2和图3同。A'.左室射血分数 B'.LDH水平 C'.CK-MB水平Fig.1 Protective effect of Nutmeg-5 on cardiac function and myocardial injury in MI model rats（n=5）Note：Compared with those in group A，###P ＜0.001；Compared with those in group B，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001（for Fig.1-3）.A'.LVEF B'.LDH level C'.CK-MB level

2.2 对MI 模型的保护作用

与A 组比较，B 组大鼠心脏梗死面积占比显著增加（P＜0.001）；与B 组比较，C1组、C2组大鼠心脏梗死面积占比均显著缩小（P＜0.05）。详见图2。

图2 肉豆蔻-5对MI模型的保护作用（n=5）A'.心肌组织TTC染色结果 B'.心肌梗死面积占比Fig.2 Protective effect of Nutmeg-5 on the MI model rats（n=5）A'.Results of TTC staining of myocardial tissue B'.Proportion of myocardial infarction area

2.3 对MI 后纤维化的保护作用

心肌组织Masson 染色结果显示，LAD 结扎4 周后，MI 模型大鼠MI 区域出现严重的纤维化，而肉豆蔻-5干预组大鼠心肌纤维化水平较MI大鼠减轻。详见图3 A'。与A 组比较，B 组大鼠的心肌纤维化程度显著升高（P＜0.001）；与B 组比较，C1组、C2组大鼠的心肌纤维化程度显著降低（P＜0.05）。详见图3 B'。

图3 肉豆蔻-5对MI模型大鼠心肌纤维化的保护作用（n=5）A'.心肌组织Masson染色结果 B'.心肌纤维化程度Fig.3 Protective effect of Nutmeg-5 on myocardial fibrosis in MI model rats（n=5）A'.Results of Masson staining of myocardial tissue B'.Degree of myocardial fibrosis

2.4 大鼠心肌蛋白质组学检测肉豆蔻-5 保护MI 的机制

为进一步研究肉豆蔻-5 保护MI 的分子机制，本课题组对大鼠心肌组织进行了蛋白质组学检测。通过4D-Label-free 定量蛋白质组学技术，得到二级质谱986 497 个，其中230 390 个在数据库中被匹配。匹配的质谱对应总的肽段数23 589个，唯一肽段总数21 964个。共3 459种蛋白在心肌组织中被辨识。共鉴定蛋白3 459种，其中3 423种被定量分析。其中，可定量蛋白数指蛋白在至少1个组别中，有超过1/2的生物学重复定量信息。

以组间差异大于1.5 倍（Foldchange ＞1.5 或Foldchange ＜0.67）及组间比较P＜0.05作为筛选组间差异表达蛋白的条件。结果显示，与A 组比较，B 组大鼠心肌组织中分别有344 个和362 个蛋白显著高表达和低表达（P＜0.05）；与B 组比较，C1组大鼠心肌组织中分别有522个和270个蛋白显著高表达和低表达（P＜0.05）。详见图4。

图4 MI模型大鼠心肌组织蛋白表达水平（n=5）A'.蛋白质组学数据火山图 B'.差异表达蛋白热图Fig.4 Protein expression levels in myocardial tissue of MI model rats（n=5）A'.Volcano plot of proteomic data B'.Heat map of differential-expressed proteins

差异表达蛋白的维恩图显示，与A 组比较，B 组有95个显著低表达的蛋白在C1组大鼠心肌组织中显著高表达（P＜0.05），而74 个显著高表达的蛋白在C1组大鼠心肌组织中显著低表达（P＜0.05），表明肉豆蔻-5对MI 的保护作用与逆转169 个和MI 有关蛋白的表达有关。详见图5。

图5 169个与肉豆蔻-5活性相关的蛋白A'.差异蛋白表达维恩图 B'.169个蛋白表达热图Fig.5 A total of 169 proteins related to Numeg-5 activityA'.Venn diagram of differential-expressed proteins B'.Heat map of 169 proteins

对169 个差异蛋白进行基因集富集分析（GSEA），5 条细胞信号通路被成功富集（P＜0.05），包括代谢通路、氧化磷酸化通路、非酒精性脂肪性肝病通路、阿尔茨海默病通路、帕金森病通路。详见图6。

图6 与肉豆蔻-5功能相关蛋白的基因集富集分析结果Fig.6 GSEA results of proteins related to Nutmeg-5 function

GSEA结果显示，代谢通路（EnrichmentScore=0.453 8，P=0.003 7）和氧化磷酸化通路（EnrichmentScore=0.492 8，P=0.044）与心脏功能密切相关，且肉豆蔻-5干预能激活代谢通路或氧化磷酸化通路，表明肉豆蔻-5保护MI活性与调控心肌代谢有关［10-11］。详见图7。

图7 169个与肉豆蔻-5活性相关蛋白基因集富集分析结果A.代谢通路 B.氧化磷酸化通路Fig.7 GSEA results of 169 proteins related to Nutmeng-5 activityA.Metabolic pathways B.Oxidative phosphorylation pathways

3 讨论

基于特殊的生存环境和生活习惯，冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病，蒙医称心赫依病）是蒙古族地区的高发病。肉豆蔻和广枣是治疗心赫依病的经典蒙药，被应用于多种经典方剂中。肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻的干燥种仁，作为香料和中药材被东南亚地区广泛使用。研究显示，肉豆蔻中主要化学成分为木脂素、新木脂素、二苯烷、苯丙烷、萜类、烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯及次要成分，如类固醇、皂苷、三萜类和黄酮类，这些化合物通过抗氧化活性、抗胆固醇血症、抗动脉粥样硬化活性而发挥对心血管疾病的保护作用［12］。广枣为漆树科南酸枣属植物南酸枣，是特色蒙药资源。中医和其他民族医学常以树皮入药，功效为解毒、收敛、止痛、止血，用于烧烫伤、外伤出血、牛皮癣；蒙医常以干燥的果仁入药，为心赫依病治疗的核心蒙药。蒙药广枣中富含有机酸、酚酸和黄酮类化合物，广枣提取物在体内外对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖的抑制作用显著，表明对病理性心肌纤维化具有保护作用［13-14］。除肉豆蔻和广枣外，肉豆蔻-5 中还包括菊科植物木香和土木香、胡椒科胡椒属植物荜茇。研究显示，木香和土木香的主要化学成分为土木香内酯、异土木香内酯、挥发油、木香内酯、脱氢木香内酯等，上述化合物均对心血管疾病有保护作用［15-17］。

在正常生理条件下，心脏所需95%的ATP 来源于脂肪酸、碳水化合物（葡萄糖、乳酸）、酮体（乙酰乙酸、β-羟基丁酸）和氨基酸的氧化磷酸化，5%的ATP 通过糖酵解途径生成，且心肌能根据外界刺激灵活地利用底物形成ATP，以维持正常的心脏功能［18］。但在病理条件下，心肌细胞能量代谢利用底物的灵活性丧失，ATP的生成更多依赖糖酵解，线粒体对脂肪酸的氧化磷酸化能力显著降低［19-20］。心肌代谢的改变归因于病理条件下的心肌细胞线粒体功能障碍和编码线粒体脂肪酸氧化磷酸化基因表达水平的降低［21-22］。研究显示，改善病理条件下心肌细胞线粒体的结构和功能有望成为维持心脏功能和治疗心力衰竭的手段，且民族医学在此方面表现出较强的优势。目前，很多民族医学方剂及提取物、中药提取物被报道能通过改善MI 后心肌细胞线粒体功能障碍和调节心肌能量代谢而发挥保护MI的作用［23-24］。本研究中的心肌蛋白质组学数据显示，MI模型大鼠的心肌代谢通路被抑制，主要涉及脂肪酸的合成，胰高血糖素信号通路，三羧酸循环及2-氧代羧酸代谢等，而经肉豆蔻-5 干预的MI 模型大鼠心肌组织中上述代谢涉及蛋白的表达水平显著升高，表明肉豆蔻-5 能通过改善MI 模型大鼠的心肌代谢而发挥保护MI的作用。

本研究尚存在一定缺陷，主要表现为肉豆蔻-5 成分复杂，虽有关于其提取物化学成分辨别的研究，但其药效物质基础未知，能干预的蛋白靶点未知。后续研究中，本课题组将着力于从蒙药基源、药效物质基础、安全性、有效性、作用靶点和作用机制方面系统评价蒙药经典方剂肉豆蔻-5 对MI 的保护作用，为挖掘其应用潜力和现代剂型的研发提供理论依据。