基于孟德尔随机化研究的先兆子痫与缺血性卒中的关联性分析

王 洋 奚 志 王 铭 修佳琦 李 冰 杨霄鹏

郑州大学第二附属医院神经内科，河南郑州 450003

先兆子痫是一种严重的妊娠期高血压疾病，通常在怀孕20 周后表现为血压升高和蛋白尿等主要症状，是导致孕产妇死亡率和发病率升高的原因[1-2]。全球范围内，卒中是主要的死亡和残疾原因之一，其中缺血性卒中占卒中总数的63%左右，给全世界带来了巨大的疾病负担[3]。多项研究表明，先兆子痫增加了孕产妇患心血管疾病、糖尿病和卒中的风险[4-6]，这些风险可能在分娩后数月至数年内出现[7]。因此研究这2 种疾病之间的联系对于预防长期卒中风险具有重要意义。但这些研究大多是观察性的，不能建立因果关系，因为可能存在混杂因素和反向因果关系的干扰。孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是一种流行病学研究方法，利用与暴露密切相关并满足特定假设的遗传变异作为工具变量[8-9]。由于这些工具变量在减数分裂时随机分配，MR 可以模拟随机对照试验，最大限度地减少混杂，并且不受外部干扰的影响，因此可提供更可靠的因果关系分析[10-11]。本研究利用大规模的全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）数据集，采用两样本MR 方法，进一步探讨先兆子痫与缺血性卒中及其亚型之间的因果关系。

1 资料与方法

1.1 资料来源

先兆子痫的汇总数据集来自FinnGen 联盟，其中包括3 903 例病例和114 753 例对照。研究的结局均来自于MEGASTROKE 联盟，并且根据Org 10172 试验在急性卒中治疗分类中进行定义，即缺血性卒中（34 217 例病例和406 111 例对照）及其3 种亚型，其中包括大动脉卒中（4 373 例病例和146 392 例对照）、小血管卒中（5 386 例病例和192 662 例对照）和心源性卒中（7 193 例病例和204 570例对照）[12-13]。

1.2 研究方法

1.2.1 研究设计 根据STROBE-MR 指南[14]，对先兆子痫和缺血性卒中与其亚型进行了两样本MR 分析，用作工具变量（instrumental variable，IV）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）必须遵循3个重要假设[15]。假设1 是工具变量与先兆子痫强相关。假设2 是工具变量独立于任何潜在的混杂因素。假设3 是工具变量仅通过先兆子痫影响缺血性卒中及其亚型。见图1。

图1 研究流程

1.2.2 工具变量选择 确定全基因组显著性阈值：首先，确定全基因组显著性阈值为P＜5×10-6，以确保选择具有统计学意义的基因型[16]。设定连锁不平衡参数阈值：将去连锁不平衡参数阈值设为r2＜0.001，同时限定遗传距离为10 000 kb，以保证所选工具变量的独立性。使用F 统计量评估工具变量：计算F 统计量来评估工具变量的弱工具变量偏倚[17]。F 统计量的计算公式为F=β2/S.E.2，其中β 表示对先兆子痫的估计遗传效应，S.E.表示遗传效应的标准误差。选择F统计量＞10 的工具变量，以确保工具变量具有足够的预测能力。进行SNP 的随机化处理：在选择工具变量之后，通过随机化方法去除模糊和回文的SNP，确保所选SNP 的准确性和一致性。检查结局数据中的P值：汇总检查结局数据中的P 值，剔除与缺血性卒中及其亚型高度相关的SNP，阈值设定为P＞5×10-6。确保所选SNP 与结局变量无关，确保工具变量的排他性。

1.2.3 MR 分析 采用逆方差加权法（inverse-variance weighted，IVW）作为主要的分析方法，并使用加权中位数法（weighted median，WM）和MR-Egger 截距法进一步证明结果的稳定性。

1.2.4 敏感性分析 用IVW 的Cochran Q 统计量检验异质性，P＜0.05 提示GWAS 数据中的遗传工具变量存在异质性，采用IVW 随机效应模型分析关联；反之，则采用IVW 固定效应模型[18]。应用MR-Egger 截距法和MR-PRESSO 方法测试多效性，如果P＜0.05 则提示结果具有显著的多效性[19]。此外，使用留一法分析测试结果的稳健性。留一法通过依次消除每个SNP分析计算剩余SNP 的结果，并与MR 分析的总效应大小进行比较，以评估结果是否受到某些SNP 的显著影响[20]。Bonferroni 校正通过对P 值的临界值进行校正，消除了所有假阳性结果出现的可能性。而P 值为0.0125～0.0500 被视为具有潜在的因果关系；P＜0.0125 被视为具有显著的因果关系。

1.3 统计学方法

采用R 4.1.2 软件“TwoSampleMR”包和“MRPRESSO”包进行数据分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

7 个与先兆子痫相关的SNP 被选择作为遗传工具变量，其F 统计量为21.21～25.08，均满足F＞10的阈值，表明弱工具变量偏倚不太可能存在。在IVW 方法中，没有证据证明先兆子痫与缺血性卒中的发病率增加相关（OR=1.05；95%CI：0.96～1.15，P=0.312）。在对缺血性卒中亚型的分析中发现，基因预测的先兆子痫可增加小血管卒中的患病风险（OR=1.21，95%CI：1.05～1.40，P=0.008），并且在MR-Egger 回归和加权中位数法中可观察到相同的效应大小方向，经过Bonferroni 校正之后，因果关系仍然显著。然而未发现先兆子痫与大动脉卒中（OR=1.12，95%CI：0.89～1.40，P=0.326）和心源性卒中（OR=1.01，95%CI：0.86～1.20，P=0.857）之间存在因果关系（图2～3）。在敏感性分析中，当探究先兆子痫与缺血性卒中及大动脉卒中的因果效应时异质性检验的P＜0.05，因此采用IVW 随机效应模型进行关联效应估计。MR-PRESSO检验未发现异常离群值的存在。MR-Egger 回归法也未发现水平多效性（图2）。留一法未发现对效应估计值影响较大的SNP，再次表明结果的稳定（图4）。

图2 先兆子痫与缺血性卒中及其亚型因果关系分析及敏感性分析结果森林图

图3 孟德尔随机化分析散点图

图4 孟德尔随机化分析“留-法”示意图

3 讨论

本研究发现遗传预测的先兆子痫与缺血性卒中（仅限于小血管卒中）之间存在因果关系。根据Chuang 等[6]的一项大型队列研究，患有先兆子痫的女性的卒中发病率更高。在整个随访期间，与对照组比较，先兆子痫患者的缺血性卒中的风险显著增加（P＜0.001），并且于分娩后1～3 年内达到峰值。这项研究显示这2 个特征之间具有相关性，而不能提供因果关系的证据。然而最近一项MR 研究显示没有证据证明先兆子痫与缺血性卒中之间具有因果关系[16]。上面所提到的研究都没有进一步探究先兆子痫对于缺血性卒中亚型的影响。本研究扩展了以前研究的不足，提示由遗传预测的先兆子痫与缺血性卒中的因果关系仅限于小血管卒中，而非所有的缺血性卒中。经过敏感性分析证明结果是稳健的。

先兆子痫对于缺血性卒中及其亚型的潜在的作用机制在很大程度上仍然是不清楚的，但已有研究提供了一些可能的解释。一是血脑屏障的破坏，由于先兆子痫本质上属于一种妊娠期高血压疾病，血压的急剧升高，导致压力迅速传递至脆弱的大脑微血管，导致血脑屏通透性增加[21]。而血脑屏障的破坏可导致血管内的液体和血浆成分外渗，从而引起脑实质局部损伤（例如腔隙性脑梗死或皮质下小梗死）[22-23]。二是脑血流自动调节紊乱，先兆子痫患者通常伴有动态脑自动调节功能受损，同时由于血管重塑或损伤加剧血管腔扩张和狭窄，脑血流灌注不足程度加重，随后局部脑实质缺氧和缺血导致缺血性卒中的发生[24-28]。三是炎症因子的多重作用，先兆子痫被认为是一种炎症性疾病，患有先兆子痫的女性循环促炎因子水平升高[29-30]。一项MR 分析研究也支持中性粒细胞计数与腔隙性卒中和小血管卒中风险增加之间存在因果关联[31]。一方面促炎因子与血脑屏障损害彼此相互作用，一些研究表明血脑屏障的损伤先于炎症，使血浆蛋白和免疫细胞能够进脑实质导致不良脑血管事件的发生，同时可起到放大神经炎症的作用；而另一些研究显示，炎症会进一步加重血脑屏障损害的程度[32-33]。另一方面多重炎症因子可引起内皮功能障碍，诱导黏附分子和趋化因子的表达，将白细胞募集到脑实质中，从而促进血栓的形成[34]。因此，由先兆子痫所引起的脑微血管的任何结构损伤都可能导致缺血性卒中的发生，仍需要进一步研究先兆子痫与小血管卒中之间的关联机制。

第一，本研究提示先兆子痫与缺血性卒中之间的因果关系仅限于特定亚型，其效应大小不容易受到反向因果关系与一些未知混杂因素的影响。第二临床公共卫生预防意义重大，先兆子痫对于脑血管的损害是持续存在的，甚至会引起“二次打击现象”，因此对于那些可能会出现先兆子痫的高危人群仍然应该长期服用抗血小板药物进行预防，以防止不良脑血管事件的发生[30，35-36]。然而，该研究仍有一些局限性。首先，这些用于推断先兆子痫和缺血性卒中之间因果关系的数据主要来自欧洲血统，因此后续需要更多的研究以确定该因果关系在其他地区和种族中是否一致。其次，本研究无法进行年龄和性别的分层分析。现有的GWAS 数据集在这2 个方面存在限制，无法提供足够的信息来进行深入的分层分析。因此，后续可考虑采集更为详尽信息的个体特征以便支持更精细地分层分析。

总之，本研究探索了先兆子痫与缺血性卒中及其亚型之间的因果关系，提示先兆子痫对小血管卒中的发病风险升高具有一定作用，对曾有先兆子痫病史的患者进行早期干预以降低缺血性卒中的发生具有重要的临床指导意义。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。