大黄酸对脂多糖诱导小胶质细胞极化表型及相关炎症因子的影响

李 倩 陈 臣 胡 燕 谢晓林 刘 涛

新疆医科大学第四临床医学院，新疆乌鲁木齐 830000

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）为急性脑血管病的一种类型，预后很差，严重威胁人类健康及社会生产力[1-2]。在我国，ICH 所占比例很高，明显高于西方国家，且给社会及家庭带来沉重的经济负担[3-4]。ICH 后的炎症反应是继发性脑损伤的重要因素，小胶质细胞被认为是最早激活的炎症效应细胞，活化的小胶质细胞有M1 和M2 两种表型，不同表型的小胶质细胞起着损伤和保护的双重作用，但这一双重作用的病理改变及其具体机制尚不明确[5-6]。动物实验研究发现，大黄能明显改善急性期ICH 大鼠的神经功能缺损评分[7-8]。因此，本研究采用大黄的有效成分大黄酸，探讨该药对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小胶质细胞极化表型及相关炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞及药物 小胶质细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司，小胶质细胞培养环境：MEM、10%FBS 及1%PS，37 ℃，5%CO2，饱和湿度。大黄酸购于上海麦克林生化科技有限公司（货号：R817294）。

1.1.2 主要试剂与仪器 胎牛血清[苏州依科赛生物（ExCell Bio）科技股份有限公司，货号：FND500]；MEM培养基（美国Gibco 公司，货号：FND500）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（杭州联科生物技术有限公司，货号：70-EK182-96）；白细胞介素（interleukin，IL）-6 ELISA试剂盒（杭州联科生物技术有限公司，货号：70-EK106/2-96）；IL-1β ELISA 试剂盒（杭州联科生物技术有限公司，货号：70-EK101B-96）；一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A014-1）；Anti-Human CD86（B7-2）PE（杭州联科生物技术有限公司，货号：85-12-0869-41）；Anti-Human CD206（MMR）PE-Cyanine7（杭州联科生物技术有限公司，货号：85-25-2069-41）。生物安全柜及CO2细胞培养箱（上海力康仪器有限公司，HF1200LC及Smart Cell HF-90）；台式低速离心机（上海安亭科学仪器有限公司，型号：TDL-60B）；流式细胞仪（美国BD 公司，货号：LSRFortessa）。

1.2 实验方法

1.2.1 CCK-8 检测细胞活力 取生长状态良好的小胶质细胞，制备成5×104个/ml 单细胞悬液，接种至96孔板中（100 μl/孔），培养过夜细胞贴壁后，取生长状态良好，汇合率达90%的小胶质细胞，胰酶消化细胞后，用培养基制备成5×104个/ml 单细胞悬液，接种至培养板中，置37 ℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养24 h 待细胞贴壁后，将细胞分为7 组，每组5个复孔。空白组以完全培养基常规培养，LPS 组加入1 μg/ml LPS 诱导4 h，不同大黄酸组分别用0.1、1、10、20、50 μmol/L 大黄酸预处理2 h 后，加入1 μg/ml LPS 诱导4 h[9]。干预完成后，收集上清，各孔加入100 μl 10%的CCK-8 溶液，并在培养箱中继续孵育，在1 h后，使用酶标仪检测450 nm 处的OD 值。

1.2.2 细胞形态观察 根据CCK-8 检测结果，最终确定大黄酸低、中、高剂量组分别为1、10、20 μmol/L，即分为空白组，LPS 组，大黄酸低、中、高剂量组，每组3个复孔。干预完成后，放置于倒置显微镜上，观察小胶质细胞形态，并取3 个视野拍照。

1.2.3 流式细胞术检测细胞中CD86+（M1 型）和CD206+（M2 型）的比例 按上述干预完成后，收集细胞，PBS 重悬洗涤2 次，离心，弃上清。加入PBS 计数至1×107/ml，吸取100 μl 细胞悬液至流式管中，每管加入5 μl CD86-PE、CD206 PE-Cy7 抗体；4 ℃避光孵育20 min，离心，弃上清，用400 μl 预冷的PBS 重悬细胞，过200 目无菌筛网；上流式细胞仪检测CD86+、CD206+细胞比例。

1.2.4 采用ELISA 检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量 取上述分组细胞上清液，进行TNF-α、IL-1β、IL-6 含量检测，参考试剂盒方法进行试剂配置，将各种试剂移至室温平衡至少0.5 h，加入300 μl 洗液静置浸泡30 s，弃洗液将微孔板拍干，标准孔加入100 μl，2 倍倍比稀释的标准品。空白孔加入100 μl 培养基，样本孔加入100 μl 细胞培养上清，每孔加50 μl 稀释的检测抗体，室温孵育1.5 h，弃液，每孔300 μl 洗液洗板6 次，每孔加100 μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育30 min。再次封板振荡室温孵育1.5 h，每孔加100 μl 显色底物，避光室温孵育5～30 min，每孔加100 μl 终止液，颜色出现变化，30 min 内使用酶标仪进行双波长检测。

1.2.4 细胞中诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）水平检测 取生长状态良好汇合率达90%的小胶质细胞，用完全培养基制备成5×104个/ml 单细胞悬液，接种至6 孔板中（2 ml/孔），培养过夜细胞贴壁后，按照上述实验方法进行干预，同时准备对照组细胞，每组6 个复孔；干预完成后，收集细胞进行iNOS 含量检测，参考试剂盒相关方法。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄酸干预后HMC3 增殖情况

大黄酸各浓度组OD 值与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 大黄酸干预后HMC3 增殖情况（）

表1 大黄酸干预后HMC3 增殖情况（）

注LPS：脂多糖。

2.2 细胞形态情况

各组HMC3 细胞形态均正常。见图1。

图1 不同浓度大黄酸干预后HMC3 细胞形态（n=3）

2.3 流式细胞术检测细胞中CD86+和CD206+的比例情况

与空白组比较，LPS 组CD86+表达量升高，CD206+表达量降低（P＜0.05）；与LPS 组比较，大黄酸中、高剂量组CD86+表达量降低，CD206+表达量升高（P＜0.05）；与大黄酸低剂量组比较，大黄酸中、高剂量组CD86+表达量降低、CD206+表达量升高（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 流式检测各组细胞表面CD86+、CD206+比例（n=3）

表2 大黄酸干预后各组细胞中CD86+、CD206+表达情况（%，）

表2 大黄酸干预后各组细胞中CD86+、CD206+表达情况（%，）

注 与空白组比较，aP＜0.05；与LPS 组比较，bP＜0.05；与大黄酸低剂量组比较，cP＜0.05。LPS：脂多糖。

2.4 大黄酸干预后各组IL-1β、TNF-α、IL-6 的表达量比较

与空白组比较，LPS 组中IL-1β、IL-6、TNF-α 表达量升高（P＜0.05）。与LPS 组比较，大黄酸中、高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α 表达量降低（P＜0.05）。与大黄酸低剂量组比较，大黄酸中、高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α 低表达量降低（P＜0.05）。见表3。

表3 大黄酸干预后各组中IL-1β、IL-6、TNF-α 表达量比较（）

表3 大黄酸干预后各组中IL-1β、IL-6、TNF-α 表达量比较（）

注 与空白组比较，aP＜0.05；与LPS 组比较，bP＜0.05；与大黄酸低剂量组比较，cP＜0.05；IL：白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α：LPS：脂多糖。

2.5 大黄酸干预后各组iNOS 活性检测结果比较

与空白组比较，LPS 组iNOS 表达量升高（P＜0.05）。与LPS 组比较，大黄酸低、中、高剂量组iNOS 表达量降低（P＜0.05）。见表4。

表4 大黄酸干预后各组iNOS 活性检测结果比较（）

表4 大黄酸干预后各组iNOS 活性检测结果比较（）

注 与空白组比较，aP＜0.05；与LPS 组比较，bP＜0.05。iNOS：诱导型一氧化氮合酶；LPS：脂多糖。

3 讨论

ICH 属中医学“中风”范畴。该病多由肝肾亏虚、肝阳上亢、脏腑气血逆乱、脑络受损所致，临床上多伴有大便秘结，腑气不通，证属本虚标实，“痰瘀交结，气血逆乱，腑气不通”是其急性期病机关键[10-11]。此病病机虽复杂，然不外乎风、火、气、虚、痰、瘀，同时该病多以肝肾亏虚为本，属本虚标实[12-13]。脑者元神之腑，其气与脏腑之气相通，脏腑功能逆乱易突发该病，且元神亦易被风、火、痰、瘀所侵扰，致“痰瘀交结，气血逆乱，腑气不通”。《神农本草经》首次提到大黄，功效“下瘀血，……荡涤肠胃，推陈致新”。因此，急性中风即投此药，则腑气畅通，升降归位，气血条畅，颅压得降，血肿消退，诸症皆消。

当发生ICH 时，小胶质细胞是首先被激活的炎症效应细胞，活化的小胶质细胞能够分泌大量的趋化因子、炎症因子、蛋白酶、其他细胞毒性产物，增加炎症细胞聚集，出现炎症放大级联效应，加重神经损伤[14-15]。活化的小胶质细胞可以分为M1 和M2 两种表型，M1样表型的激活主要发生在ICH 急性期，M2 样表型发生在亚急性和慢性期，有助于吞噬细胞碎片和血肿清除[16-17]。研究发现，脑出血后3～6 h M1 型小胶质细胞数量明显上升，而M2 型小胶质细胞升高晚1 d 且持续时间更短[18]。在ICH 中驱动小胶质细胞向M2 极化，可以减轻炎症反应达到神经保护的作用[19-20]。丁苯酞可以促进小胶质细胞M2 极化，从而减轻ICH 炎症损伤[21]。此外，抑制小胶质细胞炎症反应和自噬，能够显著减轻ICH 小鼠脑水肿，改善其神经功能[22-23]。本研究发现，大黄酸在干预LPS 诱导的小胶质细胞极化表型中M1 比例较低，而M2 型比例较高，下调IL-1β、IL-6、TNF-α 高等炎症因子表达。由此可见，大黄酸通过抑制其向M1 表型转化或诱导其向M2 表型转化，从而减轻ICH 后炎症反应。

iNOS 作为诱导酶，产生的一氧化氮能够导致氧化应激和脑水肿，在神经系统炎症反应中发挥作用重要[24]。研究表明抑制iNOS 的表达，能有效改善ICH 大鼠神经功能[25]。瑞芬太尼抑制了iNOS 的表达，亦能改善大鼠脑缺血再灌注损伤的神经功能[26]。本研究中大黄酸干预LPS 诱导的小胶质细胞后，iNOS 表达下调，与同行研究结果一致。此研究结果，可为ICH 的治疗提供一定的理论基础，亦为今后的临床研究提供一种思路或选择。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。