前体物质对泰万菌素发酵效价影响的研究

＊李芳 刘万莲 高斌 刘楠

（宁夏泰益欣生物科技股份有限公司 宁夏 750205）

引言

泰万菌素被称之为乙酰异戊酰泰乐菌素（3-acetyl-4"-isovalerytylosin，AIV），同时，也被称为超级泰乐菌素，是一种大环内酯类抗生素，主要是由耐热链霉菌经过发酵后获得，最初是由英国伊科动物保健品有限公司发现的[1]。近年来，泰万菌素是由泰乐菌素发酵转化产生的，用于生产的原料药为泰乐菌素的酒石酸盐。

泰万菌素因对鸡和猪的治疗效果明显，已成为畜牧业中常用的抗生素[2]。随着养殖业的快速发展，泰万菌素在国内外市场上的销量也在急剧增加，故在泰万菌素发酵过程中提升泰万菌素的效价是药物发展的重要研究方向。

泰万菌素属于泰乐菌素的衍生物，是动物专用第三代大环内脂类药物，唯一能真正到达支气管腔，杀灭支原体的药物，其抗菌效价是泰乐菌素的5～10 倍，替米考星的2～5 倍；碱性侧链能有效改变细胞内pH值，抑制蓝耳病病毒繁殖。用于畜禽支原体病（猪喘气病、鸡慢呼）、猪蓝耳病、猪增生性回肠炎、传染性胸膜肺炎、链球菌病的防治。泰万菌素发酵生产菌产生的乙酰化酶和异戊酰化酶，可将泰乐菌素对应位点上的羟基进行乙酰化和异戊酰化合成泰万菌素。泰万菌素制剂作为一种新型专业兽用药，具有抗菌谱广、细菌耐药性低、毒性低、残留少等优点，对原广泛使用的替米考星等同类制剂有一定的替代性，2018—2021 年，泰万菌素类产品行业产量呈增长趋势，目前公司处于满负荷生产状态，相关产品供不应求。

查阅文献，近年来研究者们主要采用基因改造手段提高耐热链霉菌的转化能力，以提高泰万菌素的发酵单位[3]。发酵过程是为耐热链霉菌提供丰富的营养环境和适宜的生长条件，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、温度、湿度及pH 等。

在泰万菌素生物合成过程中会先生成3-O-乙酰泰乐菌素或4"-O-异戊酰泰乐菌素等中间产物，再进一步乙酰化或异戊酰化合成泰万菌素，过程中会受到部分前体物质供应不足，造成泰万菌素合成过程受阻，最终导致泰万菌素发酵效价偏低。因此在泰万菌素发酵过程中补加前体物质是提高泰万菌素效价的有效方法之一[4]。

已有报道显示发酵过程补加小分子物质可以有效促进泰万菌素的合成，明显提升其发酵效价[5]。经查阅相关资料，乙酸、丙酸、丁酸等小分子酸为泰万菌素生物合成过程中的必要物质。

基于上述理论基础，本研究将乙酸、丙酸、丁酸补加至泰万菌素发酵培养基中，考察以上三种小分子酸对泰万菌素发酵效价的影响，同时探究了前体物质的添加比例、周期、浓度对其效价的影响。

1.试剂与仪器

表1 所用原材料列表

表2 所用仪器设备列表

2.材料与方法

(1)材料

泰万菌素生产菌种由宁夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

(2)方法

将泰万菌素种子液接种至种子罐中，待种子培养结束，达到移种的标准移入发酵罐进行发酵，采用单因素分析法，探究发酵过程中分别添加前体物质乙酸、丙酸、丁酸对泰万菌素效价的影响，确定最优添加物质后，再探究添加比例分别为发酵液总体积的0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%时，添加周期分别为24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 时，添加浓度分别为0.05 mol/L、0.15 mol/L、0.25 mol/L、0.35 mol/L、0.45 mol/L、0.55 mol/L 时对泰万菌素效价的影响，从而确定前体物质添加的最优工艺。

3.结果与分析

(1)不同前体物质添加种类对泰万菌素效价的影响

小分子物质可以有效促进泰万菌素的合成，常见的小分子酸有乙酸、丙酸和丁酸，本研究考察以乙酸、丙酸和丁酸三种短链脂肪酸为前体物质进行试验[6]。探究前体物质添加乙酸、丙酸和丁酸对泰万菌素效价的影响。结果如表3 所示。

表3 不同前体物质添加种类对泰万菌素效价的影响

由表3 可知，加入乙酸、丙酸、丁酸对泰万菌素的效价有显著影响，其中加入乙酸后对泰万菌素的效价提升最为明显，效价提升2.34%，故本文确定采用乙酸作为前体物质进行后续研究。

(2)不同添加比例对泰万菌素效价的影响

以乙酸作为前体物质，不同的添加比例对泰万菌素的生物合成具有不同程度的影响，合适的添加比例会对泰万菌素生物合成反应具有一定的促进作用，若发酵过程中添加浓度过大，可能会导致菌丝断裂及染菌，或对合成有抑制作用；若添加浓度较低，会导致合成不彻底，原料反应不完全[7]，故本次研究设计以发酵液总体积的0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%，6 个梯度添加比例进行试验，培养周期均为170 h。考察不同添加比例对泰万菌素效价的影响。结果如表4、图1 所示。

图1 不同添加比例对泰万菌素效价的影响

表4 不同添加比例对泰万菌素效价的影响

由表4 和图1 可知，乙酸添加比例对泰万菌素的效价有明显的影响，效价整体的变化趋势随添加比例的增加呈先上升后下降的趋势，当添加比例达到1.0%时，效价达到顶峰为35872μg/mL；当添加比例大于1.0%后，效价逐渐程呈下降趋势。故以1.0%为最优添加比例进行后续试验。

(3)不同添加周期对泰万菌素效价的影响

前体物质添加周期的长短会影响泰万菌素的效价，添加时间太早，导致无法充分参与反应，造成物质积累，影响菌丝成长；添加时间太晚导致生物合成时间较短，菌丝老化，反应不完全[8]，恰当的添加时间会影响菌丝的生命活力，从而提高效价，故本次研究共设24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，6 个添加周期进行验证，考察最优添加周期。如表5 所示。

表5 不同添加周期对泰万菌素效价的影响

由表5 可知，随着添加周期的延长泰万菌素效价呈现出规律性变化，整体的变化呈现出先上升后下降的趋势，且当添加周期在72 h 时泰万菌素效价达到峰值为35372μg/mL，相比对照增加了2871μg/mL，但当添加周期大于72 h 后，效价增长相比对照较小，故以72 h 为最优添加周期进行后续试验。

(4)不同添加浓度对泰万菌素效价的影响

以72 h 添加乙酸进行试验，筛选最优的添加浓度，在泰万菌素的发酵过程中，以0.05 mol/L、0.15 mol/L、0.25 mol/L、0.35 mol/L、0.45 mol/L、0.55 mol/L 为试验浓度，考察不同添加浓度对泰万菌素效价的影响，如表6 所示。

表6 不同添加浓度对泰万菌素效价的影响

由表6 可知，随着添加浓度的增加，对泰万菌素的效价有积极影响，添加浓度在0.35% 时，泰万菌素效价达到峰值为35020μg/mL，相比对照增长了2389μg/mL，但当浓度＞0.35%时，泰万菌素的效价逐步下降，因此可以确定添加浓度为0.35%时，泰万菌素的效价达到最优。

4.结论

综上所述，通过泰万菌素的发酵工艺优化，确认添加前体物质确实有助于提高泰万菌素的效价，本次研究主要是在泰万菌素发酵过程中，筛选出最优的前体物质添加工艺，确定乙酸作为最佳添加试剂，且添加比例为1.0%，在72 h 进行添加，添加浓度为0.35%，此方法可有效提升泰万菌素效价，表明此工艺条件能有效提高泰万菌素的效价，为生产泰万菌素的生产提供了理论依据，从而更好的满足国内外市场的需求。