大蒜精油缓释型活性包装对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)鱼片保鲜效果研究

董铮,韩楠楠,徐新月

(山东省青岛市即墨区农业农村局,山东 青岛 266200)

大黄鱼(PseudosciaenaCrocea)为广温广盐性集群洄游鱼类,是中国在国际市场上有较高知名度和竞争力的6大类名优水产品之一。大黄鱼肉质鲜嫩,营养丰富,具有健脾开胃、安神止痢等保健功效,深受消费者喜爱[1]。但是大黄鱼在内源性酶降解、脂肪氧化以及微生物作用下极易发生腐败变质,目前大多以冷冻方式贮藏,但冷冻-解冻会对鱼体的组织结构及营养品质造成一定损伤[2]。因此,探究一种能在冷藏条件下对大黄鱼等水产品进行有效贮藏的食品保鲜技术成为众多学者的研究热点。

缓释型活性包装是通过改变食品包装的环境条件,以包装材料为载体,通过某种缓释手段不断向包装环境释放和扩散抗菌剂、抗氧化剂或酶类等活性物质,从而能够在特定时间内维持最佳的保鲜浓度,达到保持食品品质和延长货架期的一类包装技术[3,4]。目前,缓释型活性包装技术在国外已经普遍用于生鲜食品加工领域[5,6],而国内对缓释活性包装技术的研究还不多,已有的研究大多集中在农产品领域[7,8],对水产品方面应用的报道还比较少。因此,缓释活性包装技术作为一种新型保鲜技术具有广阔的研究前景,对其应用于水产品保鲜的研究也是十分有必要的。

本研究所采用的缓释剂凹凸棒土,简称凹土(Attapulgite, AT),又名坡缕石,在中国南方多地如安徽、江苏、贵州等储量较为丰富。凹土是一种层链状过渡结构的含水铝镁硅酸盐矿物质,无味、无刺激、无毒性、化学性质稳定,是一种理想的食品加工助剂和食品添加剂,其物化性能与蒙脱石相类似[9]。目前,凹土已在化工、石油、食品、造纸、印染及环保领域中有所应用[9-11]。

大蒜精油具有广谱抗菌、抗氧化等生理功能,其是由大蒜素及多种烯丙基和甲基组成的硫醚类化合物,其中二烯丙基二硫醚(DADS,相对分子量146)和二烯丙基三硫醚(DATS,相对分子量178)是天然大蒜精油中较为稳定的存在形式[12-14]。因此,在一般情况下,其他精油在使用过程中遇到高温挥发性较大,主要活性成分大部分失去作用,大蒜素在高温下(吹膜需加热)虽然不稳定,但分解后可以转化为更加稳定的烯丙基硫醚类化合物,进一步发挥作用,从而使得大蒜精油的使用更为广泛,比其他精油更具优势[13]。

目前,国内外已有关于大蒜精油保鲜食品的相关研究。刘书成等[15]研究表明大蒜精油适合运用于脂肪酸含量高的食品;王磊[16]将大蒜精油应用于生猪肉的保鲜,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率高达85%;Sung 等[17]利用大蒜精油制备了抗菌薄膜包装应用于熟牛肉的保鲜,大大抑制了李斯特菌的增长率,取得了较为理想的保鲜效果。因此,大蒜精油在食品保鲜方面具有广阔的应用前景。

因此,本研究以大黄鱼鱼片为保鲜对象,将微生物指标、化学指标(K值、TVB-N、TBA)作为鲜度指标,以此探究大蒜精油缓释型活性包装薄膜对(4±1)℃冷藏条件下大黄鱼鱼片的保鲜效果,旨在延长冷藏条件下大黄鱼的货架期,并为其他水产品的冷藏保鲜提供方法参考和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料与试剂

大黄鱼:冰鲜大黄鱼购买于青岛市某水产品市场(平均大小约为400 g/条);聚乙烯(LDPE/Bycolene®Q/3201-BYC-01):巴斯夫中国(南京)有限公司;聚丙烯(PP/SINOPEC®PPB-M02-G K8003):扬子石化(南京)有限公司;乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA):北京索莱宝有限公司;凹凸棒土(BT-ATTAG-50):江苏盱眙凹凸棒土有限公司;脱臭大蒜精油(AEO):上海源叶生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

共挤复合吹膜试验机:JFG-30型,广州金中机械有限公司;紫外分光光度计:UV1101型,杭州艾普仪器设备有限公司;超净工作台:SW-CJ-2FD型,苏州安泰空气技术有限公司;真空包装机:DZT-260,深圳晟枫包装机械有限公司;高压灭菌器:MSL-3781L-PC型,松下集团;电热恒温培养箱:DNP-9052BS-III型,上海新苗医疗器械制造有限公司;高效液相色谱仪:Agilent 1260型,安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 凹土(AT)改性及凹土/大蒜精油混合物(AT/AEO)的制备

AT改性:参照田振华等[18]的方法利用盐酸和无水乙醇对AT进行酸化,并利用水解后的硅烷偶联剂KH550(浓度为1%,w/w)对AT进行偶联,通过酸化和偶联完成对AT的改性。

AT/AEO混合物的制备:以溶解度为参考指标,经过前期的试验探究,得到了改性凹土和大蒜精油的最佳质量配比为1∶25,通过搅拌制备得到AT/AEO混合物。

1.2.2 活性薄膜的制备

本研究制备了4种不同配方的双层活性薄膜,以低密度聚乙烯(LDPE)、聚丙烯(PP)为基材,并添加成膜辅助剂乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)以及不同质量分数的AEO或AT/AEO混合物。4组薄膜的配方分别如表1所示,其中表1中90% (w/w)、10% (w/w)和1% (w/w)的配比是根据前期预实验所确定的最佳配比。

表1 不同薄膜的配方Tab.1 Formulations of different films

吹膜工艺:采用双层共挤复合吹膜方法进行吹膜。吹膜机的温度设定为:膜体区250 ℃;分流器区245 ℃;螺杆区(LDPE): 175 ℃;螺杆区(PP):200 ℃。同时,为防止精油的挥发扩散,将制备好的薄膜用铝箔进行包裹保存备用。

1.2.3 大黄鱼包装前处理

将大黄鱼置于超净工作台中,去头、尾、磷和内脏,预冷无菌水清洗干净后去皮。参考Hernández等[19]的方法,对鱼肉进行分割,不同部位用于不同指标的测定。将4种不同的保鲜薄膜裁剪成大小为30.0 cm × 20.0 cm的规格并用真空包装机进行封口操作。每种保鲜薄膜做成4个包装袋,每个包装袋中放入待测的鱼肉,然后抽真空封口置于(4±1)℃条件下贮藏(并预留一部分鱼肉用于第0 d鲜鱼的各种指标的测定)。取样时间分别为:0、2、4、6、8、10 d,其中K值的测定连续取样,周期为10 d。

1.2.4 微生物评价

大黄鱼鱼肉菌落总数(TVC)的测定参照GB 4789.2—2016[20]采用平板计数培养基(PCA)倾注法计数测定。另外,选取了大黄鱼的3种优势腐败菌进行测定,分别是腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、假单胞菌(Pseudomonas)和肠杆菌(Enterobacteriaceae),在贮藏过程中采用选择性培养基对3种优势腐败菌进行平板计数[21]。

称取鱼肉10 g(精确到0.01 g)置于无菌均质袋中,加入9倍的生理盐水(w/v,鱼肉质量与生理盐水体积比),使用无菌均质机拍打成10倍稀释液。用灭菌移液器吸取稀释液1 mL,注入含有9 mL灭菌生理盐水的EP管,振摇混合均匀,制成1∶100的稀释液。按上面的操作顺序依次形成10倍递增稀释液。然后选取2～3个适宜浓度的稀释液并分别取1 mL注入灭菌平板,倾注不同的选择性培养基,摇匀,静置冷却。将平板倒置,放入生化培养箱中进行培养。培养条件如表2所示。

表2 不同微生物的培养条件Tab.2 Culture conditions of different microorganism

1.2.5 K值测定

参照张佳琪等[22]的方法对鱼肉进行前处理。HPLC检测条件:色谱柱:Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流动相:A:0.05 mol/L pH 6.68的磷酸盐缓冲液(KH2PO4与K2HPO4的摩尔比为1∶1),B:100%甲醇溶液;设置比例为:A∶B=95∶5;检测波长:254 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL;柱温:30 ℃。

K值的计算按照下列公式(1)进行:

式(1)

式中,ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx分别代表三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤,浓度采用(μmol/g,湿基)

1.2.6 挥发性盐基氮(TVB-N)含量测定

参照GB/T 5009.228—2016[23],按微量扩散法测定TVB-N,每组样品做3个平行,取平均值作为每组样品的TVB-N含量。

1.2.7 硫代巴比妥酸(TBA)值的测定

参考Siu等[24]的方法并稍作修改。称取10.0 g鱼肉于均质袋中,并加入25 mL超纯水,匀浆,再加入25 mL三氯乙酸(5%),充分搅拌均匀后静置30 min,然后使用中性滤纸过滤。取5 mL上清液于具塞试管中,加入5 mL TBA溶液(0.02 mo1/L)。将上述混合液置于(80±1) ℃的恒温水浴加热40 min,冷却至室温后,在532 nm测定吸光值A。每组样品做3个平行,结果求取平均值。TBA值用丙二醛(MDA)的质量分数表示,单位为mg MDA/kg样品。

TBA值计算公式(2)如下:

TBA(mg MDA/kg)=A532×7.8

式(2)

1.3 数据分析

本研究中所有数据均设置3组平行,数据用“平均值±标准差”表示。采用OriginPro 2016软件作图,并利用SPSS19.0软件对数据进行显著性分析,以P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 微生物评价

大黄鱼鱼片在不同保鲜膜真空包装下的微生物变化如图1所示。由图1A可知,大黄鱼鱼片的初始菌落总数(TVC)为4.76 lg CFU/g,随着贮藏时间的延长,4组样品的TVC值均呈显著增加的趋势(P<0.05),且组间存在显著性差异(P<0.05)。ICMSF[25]规定了水产品微生物的腐败临界值为7 lg CFU/g。依据微生物的判定标准,大黄鱼鱼片在4种薄膜包装下的货架期分别为4、4、7和9 d,由此可见,与前2组未添加活性物质的对照组相比,添加精油的2组薄膜(PP/LDPE+AEO和PP/LDPE+AT+AEO)可分别延长大黄鱼的货架期3 d和5 d,且与只添加精油的PP/LDPE+AEO薄膜相比,添加凹土/精油混合体系的PP/LDPE+AT+AEO薄膜可进一步延长大黄鱼鱼片货架期2 d。这说明大蒜精油对微生物的生长起到了明显的抑制作用,大蒜精油中含有的有机硫化合物分子对蛋白质分子中的巯基具有氧化作用,使微生物生长代谢所必须的酶灭活,从而可以抑制微生物的生长和繁殖[26]。在此基础上,凹土的缓释在一定程度上可达到持续抑菌的效果,进一步延长大黄鱼鱼片的货架期。

图1 不同薄膜真空包装的大黄鱼鱼片在(4±1)℃冷藏条件下(A)菌落总数、(B)腐败希瓦氏菌、(C)假单胞菌和(D)肠杆菌的变化Fig.1 The variation of (A) Total viable count, (B) Shewanella putrefaciens, (C) Pseudomonas, and (D) Enterobacteriaceae in large yellow croaker fillets with different active packaging of vacuum condition at (4±1)℃

在大黄鱼鱼片贮藏过程中,腐败希瓦氏菌、假单胞菌和肠杆菌的生长变化如图1B-D所示。初始时大黄鱼鱼片的腐败希瓦氏菌、假单胞菌和肠杆菌分别是4.38、3.18、3.00 lg CFU/g,这说明大黄鱼鱼片初始优势腐败菌是腐败希瓦氏菌。随着贮藏时间的延长,腐败希瓦氏菌、假单胞菌和肠杆菌的数量在不同贮藏时间的变化趋势基本与菌落总数变化相一致,均表现逐渐上升趋势(P<0.05),且添加活性物质的PP/LDPE+AEO薄膜和PP/LDPE+AT+AEO薄膜显著低于前两组对照组(LDPE/LDPE和PP/LDPE)(P<0.05)。这可能是由于大蒜精油中的有机硫分子对革兰氏阴性菌的细胞膜包埋蛋白更为敏感,导致细胞膜通透性的改变,从而更有效的杀死革兰氏阴性细菌[27]。同时,从图中也观察到,从贮藏时间的第4 d开始,添加凹土/精油混合体系的PP/LDPE+AT+AEO薄膜组的优势腐败菌的增长速率要显著低于只添加精油的PP/LDPE+AEO薄膜组(P<0.05)。由此表明凹土可以更有效地控制精油的释放速率,使精油缓慢释放,一方面,能够实现浓度的积累,与微生物的生长速率相一致,从而能够有效抑制微生物的生长;另一方面,精油能够逐渐从鱼体表面渗入鱼肉当中,起到持续抑菌的作用。Efrati等[28]的研究也发现了类似的结果,在线性低密度聚乙烯(LLDPE)和蒙脱石(MMT)的基础上结合百里香酚环氧乙烷制备抗菌活性膜,与对照组相比,抗菌活性延长,进一步证实了MMT的缓释功能。

2.2 K值的变化

Saito等[29]研究指出K值低于20%为一级鲜度,低于50%为二级鲜度,高于70%为腐败不可食用。大黄鱼鱼片在不同保鲜膜真空包装下K值的变化如图2所示。由图可知,大黄鱼鱼片的初始K值为(7.00±0.35)%,处于一级鲜度。在贮藏期间,4组均呈现上升趋势。由于K值主要表征鱼片贮藏前期的新鲜度,因此,以一级鲜度(≤20%)作为评判标准,未添加活性物质的对照组LDPE/LDPE和PP/LDPE薄膜组的贮藏时间都为4.5 d,而PP/LDPE+AEO和PP/LDPE+AT+AEO薄膜组可分别延长至第6 d和第6.5 d。Huang等[30]证实了桂皮油能有效抑制ATP降解,从而使草鱼 (Ctenopharyngodonidellus)鱼片保持较高的品质。因此,凹土控制的大蒜精油的持续释放可能延缓了ATP的降解,使大黄鱼鱼片保持良好的新鲜度状态。

图2 不同薄膜真空包装的大黄鱼鱼片在(4±1)℃冷藏条件下K值的变化Fig.2 The variation in K value of large yellow croaker fillets with different active packaging of vacuum condition at (4±1)℃

2.3 TVB-N含量的变化

根据GB/T 18108—2008[31]的规定,TVB-N值低于15 mg/100 g为一级鲜度,低于20 mg/100 g为二级鲜度,低于30 mg/100 g为三级鲜度,同时30 mg/100 g也被认为是水产品品质可被消费者接受的TVB-N值上限。

大黄鱼鱼片在不同保鲜膜真空包装下的TVB-N值的变化如图3所示。由图可知,新鲜大黄鱼鱼片的TVB-N的初始值为8.93 mg/100 g,一般而言,刚捕获的大黄鱼的初始TVB-N值的范围在5～20 mg/100 g之间,该测定值与李婷婷[32]测定的新鲜大黄鱼的初始TVB-N值(9.20 mg/100g)较为接近。贮藏初期,鱼片的TVB-N值较低,随着贮藏时间的延长,4个组别的TVB-N值均呈现上升趋势,尤其是第6天之后呈现显著上升趋势(P<0.05),这与微生物的数量及代谢活动规律密切相关。以30 mg/100 g为标准,当贮藏期为第6 d时,未添加活性物质的PP/LDPE薄膜和LDPE/LDPE薄膜组已基本达到可食用上限,而PP/LDPE+AEO薄膜和PP/LDPE+AT+AEO薄膜组可分别延长至第7、第9 d。这说明大蒜精油的添加对微生物的生长代谢起到了一定程度的抑制作用,由于精油组未添加缓释剂,因此扩散速度较快,在较短的时间内就达到了平衡状态,不再随时间的延长而向外释放,而添加了缓释剂的薄膜组在控制精油释放速率方面发挥了一定的作用,呈现一种“缓慢但持久”的释放状态,随着时间的推移,精油从薄膜中缓慢释放,对细菌的生长产生持续抑制,进而显著降低挥发性盐基氮的产生水平[33]。

图3 不同薄膜真空包装的大黄鱼鱼片在(4±1) ℃冷藏条件下挥发性盐基氮含量的变化Fig.3 The variation in volatile basic nitrogen (TVB-N) content of large yellow croaker fillets with different active packaging of vacuum condition at (4±1)℃

2.4 TBA值的变化

大黄鱼鱼片在不同保鲜薄膜真空包装下TBA值的变化如图4所示。由图观察可知,大黄鱼鱼片的初始TBA值为0.46 mg MDA/kg,贮藏期间所有样品的TBA值都显著增加(P<0.05)。当到达贮藏末期时,前2组未添加活性物质的对照组(LDPE/LDPE和PP/LDPE)的TBA值分别达到了6.48和5.99 mg MDA/kg,同时,只添加了大蒜精油的对照组(PP/LDPE+AEO)略有降低,而添加凹土/精油混合体系的实验组(PP/LDPE+AT+AEO)则显著降低(P<0.05),二者的TBA值分别为5.56和5.08 mg MDA/kg。从贮藏前期(0～4 d)来看,只添加了大蒜精油的对照组(PP/LDPE+AEO)的TBA值比添加凹土/精油混合体系的实验组(PP/LDPE+AT+AEO)要略低,而第4 d之后,实验组(PP/LDPE+AT+AEO)逐渐发挥优势,产生这种变化的主要原因可能跟凹土的缓释有关,精油的释放速率受到凹土的控制,通过缓释作用实现精油浓度的逐渐积累,且达到持久释放的效果,从而可以对鱼肉的脂质氧化起到一定的抑制作用[34]。杨辉[35]的研究证实了葡萄籽精油与EVOH薄膜结合后可有效抑制脂肪的氧化,降低草鱼的TBA值。

3 结论

本试验是以微生物指标(菌落总数、腐败希瓦氏菌、假单胞菌、肠杆菌)和化学指标(K值、TVB-N、和TBA)作为鲜度指标,以此评估含有凹土/精油混合体系的缓释型活性包装(PP/LDPE+AT+AEO)对大黄鱼鱼片在冷藏状态下的保鲜效果。各鲜度指标表明,与对照组相比,PP/LDPE+AT+AEO薄膜所包装的大黄鱼鱼片呈现出了最理想的鲜度状态。以菌落总数小于7 lg CFU/g作为消费者可食用标准并结合TVB-N(30 mg/100 g)等指标,与市场对照组(LDPE/LDPE)相比,PP/LDPE+AT+AEO薄膜能够有效延长大黄鱼鱼片货架期约3～5 d,同时,与只添加精油的对照组(PP/LDPE+AEO)相比,同样能够延长货架期约2 d,达到了预期的试验目的。由此表明,本试验研制的大蒜精油缓释型活性薄膜能够有效延长大黄鱼鱼片的货架期,在水产品保鲜领域具有广阔的应用前景。同时也为今后研究活性包装中抗菌剂和抗氧化剂的释放方式和优化薄膜的控释手段奠定了基础。