健康献血者血浆可溶性糖蛋白A(GPA)在抗-M与抗-“Mia”抗体阳性及阴性中表达差异的分析研究

梁延连，邬林枫，唐雄驰，苏宇清，吴 凡，梁 爽，孙丽艳（.深圳市血液中心输血医学研究所，广东深圳 58040；.广西平南县人民医院，广西平南 537300）

MNS 血型是由50 种抗原组成的血型系统，其抗原的多态性主要由于同源基因GYPA/GYPB/GYPE 的重组、突变、融合、交换等[1]。MNS 血型系统的抗原由血型糖蛋白A（glycoprotein A，GPA）与糖蛋白B（glycoprotein B，GPB）的相关基因GYPA 与GYPB 编码。不仅输血、妊娠或器官移植等免疫会导致机体产生红细胞不规则抗体，一些慢性炎症或烧伤患者血浆中也常常检出抗-M抗体，有证据表明儿童受细菌感染后被刺激产生抗-M 抗体[2]，这类抗体被称为“天然抗体”，在低于37℃条件下反应增强。抗-M 与抗-“Mia”是MNS 血型系统中最常见的抗体，有时表现出剂量效应，约78%的抗-M 抗体为IgM/IgG 混合型，可与M 抗原阳性细胞发生凝集[3]，不仅会影响ABO血型鉴定，还会导致交叉配血困难与溶血性输血反应。据研究，GPA/ GPB 蛋白异构体可以直接影响MNS 血型抗原在红细胞上的表达量[4]。为了解不同个体血浆中可溶性GPA 表达量的差异，本文检测了健康献血者血浆中的GPA 含量，同时分析不规则抗体阴性个体与血浆中存在抗-M 与抗-“Mia”抗体阳性个体间的差异，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 样本来源于2022年2月9日～2023年2月15日的深圳市血液中心健康献血者血浆，常规筛查了111 156 例血浆的不规则抗体，对阳性样本进一步鉴定抗体特异性。从中随机选择不规则抗体阴性的NN 型（Ⅰ组，n=118）与MM 型（Ⅱ组，n=51），血浆中存在抗-M 抗体的NN 型（Ⅲ组，n=145）与抗-“Mia”抗体的随机型（Ⅳ组，n=87），分别测定血浆中GPA 的含量。所有样本收集均经过书面知情同意并通过血液中心伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 SUNRISE 温控酶标仪，Diamed-ID 12SI 卡式离心机，Diamed-ID 37SI 孵育器，日本KA-2200 血型血清学离心机。人糖蛋白A（GPA）ELISA 检测试剂盒（上海纪宁实业有限公司，批号：202302）；单克隆鼠抗人血清anit-M（IgM 性质，批号：20210608，20220725），anit-N（IgM 性质，批号：20210407）由上海血液生物科技有限责任公司提供；不规则抗体筛查细胞（广东营安生物科技有限公司，批号：20220901）；不规则抗体鉴定谱细胞Makropanel 16（广东营安生物科技有限公司，批号：20220906）；Liss/抗人球蛋白卡（BIO-RAD，批号：50531.66.14）；样本稀释液（瑞士Diamed公司，批号：057610005）。

1.3 方法

1.3.1 抗体与血型鉴定：使用筛查细胞对健康献血者111 156 例的血浆进行不规则抗体筛查，应用谱细胞对抗体筛查阳性的血浆进行抗体特异性鉴定，严格按照抗-M 与抗-N 试剂说明书操作规程检测MN 抗原的表现型。

1.3.2 样本分组：不规则抗体阴性的NN 型与MM型作为对照组，血浆中存在抗-M 抗体的NN 型与抗-“Mia”抗体的随机型作为研究对象组。

1.3.3 GPA 含量测定：采用ELISA 方法检测对照组与研究对象组不同个体血浆中GPA 的含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析 采用Graphpad Prism 7.0 软件对相关数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 不规则抗体频率 检出111 156 例的健康献血者血浆不规则抗体阳性共716 例，阳性率0.64%（716/111 156）。其中抗-M 抗体阳性145 例，占不规则抗体阳性群体的20.25%（145/716）；抗-“Mia”抗体阳性87 例，占不规则抗体阳性群体的12.15%（87/716）。

2.2 血浆GPA 平均含量 Ⅰ组，Ⅱ组，Ⅲ组和Ⅳ组血浆中GPA 平均含量依次为：9.941±0.252，10.970±0.256，5.139±0.129 和4.28±0.139ng/ml，两两比较，差异具有统计学意义（t=2.82,18.65,19.00,21.80,23.01,均P＜0.001）。Ⅰ组与Ⅱ组的GPA 平均含量较高，Ⅲ组与Ⅳ组的GPA 平均含量较低，显示GPA 平均含量在不规则抗体阴性（Ⅰ组与Ⅱ组）的血浆中较高，在抗-M 与抗-“Mia”抗体阳性（Ⅲ与Ⅳ组）的血浆中较低，差异具有统计学意义（均P＜0.01）。

3 讨论

人类血型糖蛋白（GP）主要包括GPA，GPB，GPC，GPD。GPA 不仅在人类红细胞表面具有高表达的特征，还表达于人体的肝、肾、血管等器官与组织液（细胞膜、细胞外液、血浆以及黏液）中[5]。GPA 位于红细胞膜外的糖基化N 端，具有MN 血型特异性的位置是外来生物：流感病毒、恶性疟原虫、大肠埃希菌、甲型肝炎病毒(HAV)或寄生虫的受体[6]。GPA/GPB 相关基因GYPA/GYPB 家族的核苷酸具有多态性，GYPA 与GYPB 基因发生交换或融合会导致GPA/GPB 融合为GP(A-B-A)，GP(B-A-B）等多态性表达，而这种基因的转换和平衡的选择正是一些病毒与寄生虫感染的受体[7]，因此，人类群体中有部分人即使无输血，妊娠或器管移植的免疫过程也产生了抗-M 或抗-“Mia”抗体。GP 除了携带MNSs 血型系统的抗原和Gerbich血型抗原决定族参加机体的免疫反应外，还可以参与宿主-病原体的相互作用。GPA 相关基因GYPA的异常表达与2 型糖尿病或某些心血管疾病和癌肿相关，同时，GYPA 基因座的突变频率已作为大规模筛查环境放射与化学污染的常规手段[4]。还有研究发现，GPA/GPB 在血浆中的浓度与高脂血症、动脉粥样硬化相关，也是亚临床慢性炎症、慢性感染、糖尿病和自身免疫性疾病的生物标志物[8-9]。GPA 作为一种可溶性糖蛋白，它在人体血浆中的表达量与蛋白结构的变异与人类疾病息息相关，是疾病诊断的重要标记。糖蛋白A（GPA）在人体血液中不仅可以维持红细胞膜表面的负电荷恒定，防止红细胞聚集，还可以间接影响红细胞膜的柔性和机械稳定性。另外，GPA 的糖蛋白残基与病毒或细菌结合后会引发红细胞膜刚性结构的变化，在受免疫致敏后有可能产生相关抗原的同种抗体。GPA 表达的M 或“Mia”抗原的多态性影响抗-M 抗体或抗-“Mia”抗体的特异性，而GPA 由相关基因GYPA 编码，GYPA基因序列中碱基的变异可以把MN 血型基因区分为M101，M102，M103，M201，M202，N101，N102，N103，N104 和N201[10]型，由此不同个体血浆中的抗-M 抗体与异体间M 抗原阳性者反应时出现剂量效应或强弱不同的凝集现象。另有研究者认为，抗-“Mia”抗体的产生与HLA-DRB1*0901基因密切相关，HLA-DR4，DR7 和DR9 分子可能比其他表型更积极地参与激活抗MiШ 糖蛋白的免疫应答，HLA-DR9 个体的细胞可能比其它表型的细胞更有效地诱导抗-“Mia”抗体的产生[11-12]。为探讨GPA 在人体血浆中的表达量与抗-M 与抗-“Mia”抗体之间的相关性，本文通过筛查111 156 例健康献血者血浆的不规则抗体，发现红细胞血型不规则抗体阳性有716 例（0.64%），除了Rh 血型系统的抗-E 与抗-c 抗体以外，主要以MNS 血型系统的抗-M 或抗-“Mia”抗体为主，其中抗-M 抗体在不规则抗体阳性群体中占20.25%，抗-“Mia”抗体占12.15%。GPA 在不同个体血浆中的表达量存在差异：在不规则抗体阴性个体血浆中较高，在抗-M 与抗-“Mia”抗体阳性的个体血浆中较低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。这种差异是否提示了血浆中的抗-M 与抗-“Mia”抗体具有中和可溶性GPA 的能力？需进一步跟踪监测产生抗-M 与抗-“Mia”抗体前及抗体消失后血浆中GPA 表达量的变化来验证。

综上，对健康献血者不同个体血浆中GPA 的定量检测，发现GPA 表达量与血浆中存在抗-M 及抗-“Mia”抗体的群体具有相关性，存在统计学差异。该研究结果为深入探讨血浆中GPA 与机体被外界环境或同种抗原免疫后产生抗-M 及抗-“Mia”抗体的机理提供数据参考，为提高疾病诊断与安全输血打下基础。