氧化条件下姜黄素对猪肉肌原纤维蛋白理化和凝胶特性的影响

常海军，石源伟，伯朝英，周文斌，胡 渝

（重庆工商大学环境与资源学院，重庆市特色农产品加工储运工程技术研究中心，重庆 400067）

肌原纤维蛋白占肌肉总蛋白的55%～60%，是肌肉中含量最高的一种蛋白，主要由肌动蛋白和肌球蛋白构成[1]。肌原纤维蛋白的一个重要特性就是在热加工过程中能形成凝胶，对肉制品的保水性、质构和感官等起着至关重要的作用[2]。然而肉蛋白在运输、储存以及加工过程中易受到外界环境的影响发生氧化，导致其物理化学和结构性质的变化，蛋白氧化对肌原纤维蛋白功能特性的改变是影响肉和肉制品品质的主要因素，氧化导致蛋白质分子间共价交联，可促进凝胶化和乳化的可溶性聚合物或不溶性聚合物的产生，从而降低其凝胶性能，影响产品的质量[3]。植物多酚的介导会影响蛋白质分子间共价键交联，对凝胶保水性、流变学特性、弹性模量、凝胶强度等凝胶特性产生影响，从而影响蛋白凝胶性能[4]。Chen Bo等[5]研究发现添加谷胱甘肽会促进肌原纤维蛋白中二硫键的形成，增加蛋白质的交联作用，提高其凝胶特性，同时研究表明植物多酚类物质会和蛋白质发生共价或非共价修饰作用，进而影响其蛋白凝胶稳定性。

近年来，天然植物多酚因其来源广泛、价格低廉、种类繁多、安全性高等优点而备受关注。目前，研究以植物多酚为代表的天然抗氧化剂诱导调控肌肉蛋白氧化及对功能特性的影响已成为肉品科学技术领域的研究热点。姜黄素是从姜科植物根茎中分离的一种具有二酮结构的多酚化合物，是一种广泛使用的天然活性物质之一[6]，作为一种食品添加剂，姜黄素还具有抗炎、抗癌、抗菌、抗氧化等多种生物活性功能[7]。因副作用小、价格低且容易获得，姜黄素在食品营养及医药方面的重要性逐渐凸显出来，它的生物学作用成为近年来的研究热点之一，其中最受关注的是抗氧化作用。

虽然姜黄素在许多方面的生物活性得到广泛的研究，但是在肉蛋白抗氧化或与蛋白相互作用方面的研究仍较少。目前鲜见针对植物多酚姜黄素用于调控肉蛋白氧化程度提高肉制品品质相关报道，其调控肉蛋白氧化稳定性和凝胶特性机理尚待进一步阐明。因此，本研究以猪肉肌原纤维蛋白为对象，创建Fenton氧化体系模拟肉制品的氧化环境，探究不同浓度水平姜黄素对肌原纤维蛋白热诱导凝胶特性的影响，以期为天然多酚类物质在肉制品抗氧化中应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪背最长肌购于重庆市南岸区五公里人人乐超市。剔除可见的脂肪组织后，顺着肌纤维方向切成100 g左右的肉条，真空密封包装后，贮存于4 ℃备用。

十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、氯化镁（MgCl2）、三氯乙酸、戊二醛、叔丁醇、冰醋酸成都市科龙化工试剂厂；姜黄素（纯度≥97%）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、牛血清白蛋白、酒石酸甲钠（NaKC4H4O6）、氢氧化钠（NaOH）、L-抗坏血酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸、水溶性VE（Trolox）、尿素、考马斯亮蓝染色液、聚丙烯酰胺 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯化铁（FeCl3）、双氧水（H2O2，30%）、β-巯基乙醇 上海阿达玛斯试剂有限公司；标准蛋白（Marker）北京索莱宝科技有限公司；所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MARS40（哈克）旋转流变仪 赛默飞世尔科技有限公司；S-8020扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；TAXT Plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司；CR400色差仪 日本美能达公司；TGL-20高速冷冻离心机 四川蜀科仪器有限公司；LM-861多功能破壁机 广东顺德多蒙电器有限公司；DGG-9076A电热恒温鼓风干燥箱上海齐欣科学仪器有限公司；L G J-1 0 冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司；Ultra-Turrax T25高速均质匀浆机 德国IKA-WERKE公司；V2000可见分光光度计、FA2004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；UV-1900紫外-可见分光光度计 上海翱艺仪器有限公司；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYCZ-MINNI2电泳仪 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取及浓度测定

以猪背最长肌为原材料，参照Cao Yungang等[8]的方法提取肌原纤维蛋白：将冷藏备用的肉切成小块置于绞肉机中并加入4 倍体积的肌原纤维蛋白提取液（10 mmol/L磷酸钠、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH 7.0）于点动模式下运行30 s，再于长动模式下运行1 min，匀浆后经冷冻离心（8 000×g、10 min、4 ℃），倾去上清液，所得沉淀再加入4 倍体积的肌原纤维蛋白提取液，重复提取3 次，最后将所得沉淀加入4 倍体积的0.1 mol/L NaCl溶液，搅拌均匀并用3 层纱布过滤以除去残余的结缔组织，调节pH值为6.25后离心（8 000×g、10 min、4 ℃），所得白色膏状沉淀即为肌原纤维蛋白。整个提取过程在0～4 ℃条件下进行，肌原纤维蛋白于4 ℃保存并48 h内使用。采用周非白[9]所述的双缩脲法测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白作为标准蛋白，制作蛋白质的标准曲线。

1.3.2 氧化介导的姜黄素-肌原纤维蛋白凝胶的制备

凝胶的制备参照Lv Yuanqi等[10]的方法并稍作修改，准确称取5 g上述1.3.1节中所提取的肌原纤维蛋白于50 mL离心管中，加入20 mL不同浓度梯度姜黄素（0（blank）、5、10、15、20 μmol/L），同时制备不含抗氧化剂但含有氧化因子（5 mmol/L H2O2）的氧化对照组（o x），均质后，于4 ℃氧化反应12 h，再加入1 mL Trolox（终浓度为1 mmol/L）振荡摇匀，再置于室温平衡30 min待离心管壁上不再有大量的蛋白样液后，密封好，将样品置于水浴锅中，从室温（25 ℃左右）缓慢升温至80 ℃（2 ℃/min）再保温10 min，取出置于冰水中冷却至常温，置于4 ℃环境中贮藏过夜。在测定凝胶性能之前，应该将制得的凝胶样品取出在常温中平衡2 h之后再进行下步操作。含0、5、10、15、20 μmol/L姜黄素的组别分别命名为blank、ox+c5、ox+c10、ox+c15、ox+c20。

1.3.3 肌原纤维蛋白凝胶特性测定

1.3.3.1 凝胶白度

凝胶色差值的测定参照Xia Xiufang等[11]的方法，色差仪经自检、调零、白板校正后，进行凝胶样品的测定，每个样品测定3 次，取其平均值。其中L*表示明暗度，数值越大表示越亮，相反则越暗；a*表示红绿度，正值表示偏红，负值表示偏绿；b*表示黄蓝度，正值表示偏黄，负值表示偏蓝。凝胶白度的计算如式（1）：

1.3.3.2 凝胶蒸煮损失与保水性

凝胶蒸煮损失测定：蒸煮前准确称取离心管的质量记作m0/g，凝胶和离心管的总质量记作m1/g，蒸煮（具体步骤同1.3.2节）后倒掉水分后称其总质量为m2/g，肌原纤维蛋白凝胶蒸煮损失计算如式（2）：

凝胶保水性的测定：参照熊杰[12]的方法并稍作修改，准确称取1.3.2节制得的凝胶10 g分装于离心管中，离心（4 ℃、8 000×g、15 min）除去水分，称质量，每个样品重复操作3 次，凝胶保水性的计算如式（3）：

式中：M1为离心后离心管与凝胶的总质量/g；M2为离心前离心管和凝胶的总质量/g；M0为离心管质量/g。

1.3.3.3 凝胶强度与质构

凝胶强度测定：利用质构分析仪测定凝胶的强度，同样将平衡2 h除去可见的游离水的凝胶置于测试平台上固定好，进行Return to Start测试。探头型号：P/0.5，触发力：5 g，下压距离：6 mm，测前速率：2 mm/s，测中速率：1 mm/s，测后速率：2 mm/s。

凝胶全质构测定：参照韩馨蕊等[13]的方法并略加修改，利用质构分析仪测定凝胶的全质构，将平衡2 h除去可见的游离水的凝胶置于测试平台上进行全质构测定。探头型号：P/75，下压比：50%，触发力：5 g，测前速率：2 mm/s，测试速率：1 mm/s，测后速率：1 mm/s。

1.3.4 肌原纤维蛋白凝胶动态流变学特性测定

不同处理方式的样品凝胶动态流变学特性的测定方法参照Du Juanjuan等[14]描述的方法并稍作修改，肌原纤维蛋白凝胶（0.2 g/mL），经离心（4 ℃、800 r/min、30 s）脱气后备用。采用振荡温度扫描测试模块，安装P20/Ti-01210465型转子，仪器调零后，将脱气的样品均匀布满在仪器平台上，用硅油密封平板外蛋白质和空气的接触位置，以防加热导致蛋白液蒸发，再进行20～80 ℃的温度扫描。测定参数：振荡频率为0.1 Hz，最大应力为2%，上下板狭缝为1 mm，以2.1 ℃/min的升温速率加热样品，在此过程中记录凝胶的储能模量（G’）和损耗模量（G”）。

1.3.5 肌原纤维蛋白凝胶分子间作用力测定

参照Zhang Zhongli等[15]的描述并稍作修改，将1.3.2节制得的凝胶准确称取2 g加入10 mL S1（0.6 mol/L NaCl），6 000 r/min匀浆2 min，于4 ℃放置1 h后离心（4 ℃、8 000×g、20 min），4 ℃保留上清液；上述沉淀加入10 mL S2（1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl混合溶液），6 000 r/min匀浆2 min，于4 ℃放置1 h，相同条件下离心20 min，上清液于4 ℃保存；将上述沉淀加入10 mL S3（8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl混合溶液），6 000 r/min匀浆2 min，于4 ℃放置1 h，相同条件下离心20 min，上清液于4 ℃保存，重复此操作，将两次离心的上清液合并，4 ℃保存；继续向沉淀中加10 mL S4（0.5 mol/Lβ-巯基乙醇、0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素混合液，pH 7），6 000 r/min匀浆2 min，于4 ℃放置1 h，相同条件下离心20 min，上清液于4 ℃保存，经S4提取后所得沉淀加入2 mL 0.1 mol/L NaOH充分溶解后于4 ℃保存。通过双缩脲法测其上清液的蛋白含量。其中离子键：以溶解于S1的蛋白含量表示；氢键：以溶解于S2的蛋白含量表示；疏水键：以溶解于S3的蛋白含量表示；二硫键：以溶解于S4的蛋白含量表示；非二硫键：以经S4提取液后所得沉淀溶于NaOH的蛋白含量表示。

1.3.6 肌原纤维蛋白凝胶微观结构观察

参照Zhao Yinyu等[16]描述的方法，将制得的凝胶样品准确称取10 g，用小刀切成2 mm×2 mm×5 mm的小条，加入10 mL 2.5%戊二醛溶液（溶于磷酸缓冲液中，pH 6.8）浸泡过夜，固定12 h后加入10 mL磷酸缓冲液（0.1 mol/L、pH 6.8）洗涤3 次，每次10 min，随后依次用体积分数50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液进行脱水处理，每次10 min，再用10 mL无水乙醇脱水，每次10 min，共3 次。脱水完成后再加入10 mL氯仿进行脱脂1 h，再用无水乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V），以及叔丁醇各进行置换1 次，每次15 min，最后将样品冷冻24 h后于冷冻干燥机中干燥。干燥后的样品紧贴于扫描电子显微镜样品台上并喷金处理，加速电压为2.0 kV，放大30 000 倍进行观察。

1.3.7 肌原纤维蛋白凝胶电泳

电泳样品制备参照曹云刚[17]所描述的方法进行，准确称取5 g蛋白凝胶，研磨之后置于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 5%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，3 000 r/min均质1 min后于80 ℃水浴1 h，取出冰水冷却至室温，离心（3 000×g、15 min），以除去不溶物。将上清液用哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲溶液稀释至20 mg/mL后用于电泳样品的制备，其余过程与蛋白样液电泳操作步骤相同。

1.4 数据处理

每组样品设置3 个平行组，实验测试重复3 次，所有数据用表示，利用SPSS 23.0进行误差及显著性分析（其中P＜0.05为有统计学意义），用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 肌原纤维蛋白凝胶特性分析

2.1.1 凝胶白度

由图1可知，与空白对照组相比，氧化后凝胶白度变化不显著（P＞0.05），说明5 mmol/L H2O2氧化下，蛋白凝胶白度未受到明显的影响。但是加入姜黄素后，凝胶白度显著性降低（P＜0.05），且随着姜黄素浓度的增加，凝胶白度降低，5、10、15、20 µmol/L姜黄素处理后，肌原纤维蛋白凝胶白度与氧化对照组相比，分别下降了2.15、6.59、10.01和11.15，可能与姜黄素与肌原纤维蛋白相互作用有关，姜黄素的加入会导致凝胶保水能力的增加，即凝胶三维网络结构内的结合水较多，相对而言肌原纤维蛋白表面的自由水含量降低，导致光折射能力下降进而L*值降低，最后导致凝胶白度的降低[18]，其次可能是因为姜黄素是一种自带黄色程度较深的天然植物多酚类物质，虽然添加的量不多但也会影响凝胶的红绿度（a*）和黄蓝度（b*）值，进而影响其凝胶白度。

图1 不同处理对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响Fig.1 Effects of different treatments on the whiteness of MP gels

研究发现一些植物多酚的加入会产生蛋白凝胶白度下降的现象，如韩馨蕊等[13]认为安石榴苷（黄色）的添加也会导致凝胶白度的降低，刘丹[18]研究发现染料木素在较高浓度条件下使凝胶白度降低，随着芦丁和槲皮素浓度的增加，凝胶白度逐渐降低，这可能就是由于酚类物质本身颜色所影响，而没食子酸和儿茶素出现低浓度条件下使凝胶白度降低、高浓度条件下使凝胶白度增加的现象，这可能是因为低浓度条件下植物多酚与Fe3+螯合，以及酚类物质氧化形成醌类化合物使得凝胶白度降低，而高浓度条件下，两种酚类物质使得凝胶三维网络结构崩塌，破坏了蛋白的结构。同时Wang Yingjie等[19]研究发现酚类化合物紫檀芪（白色粉末）也会降低肌原纤维蛋白凝胶的白度，认为是紫檀芪可以显著提高凝胶特性所致。

2.1.2 蒸煮损失与保水性

蒸煮损失与保水性是评价凝胶品质极为重要的因素之一，可反映凝胶内部结构截留水分能力的大小[20]，如图2和图3所示，与空白对照组相比，氧化后凝胶蒸煮损失显著性增加（P＜0.05），增加了58.18%，凝胶保水性显著性降低（P＜0.05），降低了15.35%，这与前人的研究结果一致，Cao Yungang[21]和Wang Zhaoming[22]等均发现氧化后凝胶蒸煮损失增加和保水性下降的现象。而姜黄素的添加正好可以减少蒸煮损失的增大与保水性的降低，且随着姜黄素浓度的增加，对凝胶蒸煮损失的降低和保水性的提高更明显，当姜黄素浓度为20 µmol/L时，与氧化对照组相比，凝胶蒸煮损失降低了18.61%，凝胶保水性提高了32.31%。该现象可能由以下原因造成：首先，姜黄素是二酮结构的多酚化合物，在一定程度上可以抑制蛋白的氧化，且自身的羟基结构具有良好的亲水能力，因而姜黄素的添加可以降低其凝胶的蒸煮损失和提高保水性[23]；其次，姜黄素的添加会引起肌球蛋白的解离，提高体系内离子强度，通过静电相互作用力增强其凝胶的水合作用，使凝胶网络结构更加紧密，提高其保水能力，从而降低蒸煮损失，叶浪等[24]研究认为凝胶保水性增强可能是由于肌原纤维蛋白引入磷酸基团，增加了蛋白质分子的电负性，肌动球蛋白解离成肌球蛋白和肌动蛋白的速率增大，疏水基团增多，肌原纤维蛋白凝胶网络结构空间增大，蛋白质与水分子结合位点增加，使更多水分被保留下来。

图2 不同处理对肌原纤维蛋白凝胶蒸煮损失的影响Fig.2 Effects of different treatments on the cooking loss of MP gels

图3 不同处理对肌原纤维蛋白凝胶保水性的影响Fig.3 Effects of different treatments on the water retention capacity of MP gels

2.1.3 凝胶强度

凝胶强度可以反映蛋白凝胶成形能力的大小。由图4可知，空白对照组的凝胶强度显著性高于氧化组（P＜0.05），说明5 mmol/L H2O2氧化体系下产生的羟自由基会导致蛋白质原有的结构改变，使得蛋白凝胶成形性降低，这与前人的研究结果一致，程镜蓉[25]和Feng Xianchao[26]等研究发现羟自由基体系下，蛋白凝胶强度会显著性下降，而当加入姜黄素之后，肌原纤维蛋白凝胶强度迅速增加，甚至凝胶强度高于空白对照组，5、10、15、20 µmol/L姜黄素处理后，凝胶强度与空白对照组相比分别上升了132.72%、156.41%、170.67%、183.20%，说明姜黄素的加入可以防止羟自由基损坏肌原纤维蛋白凝胶且大大提高肌原纤维蛋白凝胶性能。这可能是因为姜黄素的加入可以提高蛋白质的溶解度，从而使参与蛋白质成胶的大分子物质更多，使得凝胶强度更大；其次姜黄素的加入可以提高凝胶持水性，所以此时凝胶更加饱满，结构更加稳定致密，故而姜黄素的添加有更强的凝胶强度。Tang Changbo等[27]的研究结果与本研究相反，他们发现迷迭香酸加入后半胱氨酸会与迷迭香酸形成结合物，减少二硫键的形成，最终导致凝胶强度的减弱，这可能是由于植物多酚的不同而导致了完全相反的实验结果。

图4 不同处理对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响Fig.4 Effects of different treatments on the gel strength of MPs

2.1.4 凝胶质构

不同处理方式对肌原纤维蛋白全质构影响如表1所示。与空白对照组相比，氧化后凝胶的硬度、弹性、凝聚性、胶黏性、咀嚼性和回弹性均出现了显著性降低的趋势，其中硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性分别降低了28.36%、68.53%、34.77%、37.70%。

表1 不同处理方式对凝胶全质构的影响Table 1 Effects of different treatments on the texture characteristics of MP gels

凝胶硬度是指仪器探头首次下压凝胶时，压力达到的最大值，它是衡量凝胶质构特性的重要指标之一[28]。由表1可知，凝胶的硬度随着姜黄素浓度的增加整体呈上升趋势（P＜0.05），其中胶黏性、咀嚼性与硬度的变化趋势一致，说明姜黄素的添加有利于凝胶的形成。

不同姜黄素添加量对凝胶改善程度也有所不同，当姜黄素浓度为20 µmol/L时，与氧化对照组相比，凝胶硬度、弹性、凝聚性、胶黏性和咀嚼性分别提高了31.08%、8.89%、9.09%、39.88%、55.55%。这可能是因为姜黄素含有2 个邻甲氧基酚基、2 个烯酮基和1 个酮烯醇的结构，具有较强的亲水能力，使得水合作用更强，从而增加了凝胶特性。Sun Lijun等[29]研究了苹果多酚对鱼糜凝胶特性的影响，发现苹果多酚的羟基结构具有较强的亲水能力，可以增加凝胶特性。同时姜黄素的酚羟基结构还可以与蛋白质中的C＝O基团形成氢键，增强蛋白质与多酚之间的相互作用[30]。贾娜等[31]研究了在氧化情况下槲皮素对猪肉肌原纤维蛋白凝胶的影响，发现槲皮素会和肌原纤维蛋白结合形成巯基-醌加合产物，增加凝胶强度。

2.2 肌原纤维蛋白凝胶动态流变学特性

肌原纤维蛋白的动态流变学特性可以反映蛋白热诱导凝胶形成能力的改变[32]。G’也称为弹性模量，它能够反映随着温度的变化凝胶弹性的变化，G’越大则表示凝胶弹性越好；G”也称为黏性模量，它是指材料发生形变时，由于黏性形变（不可逆）而损耗的能量大小，用于反映材料黏性的大小，G”越大则表示黏性越大[11]。

如图5所示，氧化对照组和空白对照组以及样品组在40～50 ℃热诱导下凝胶储能模量均出现了相似的上升趋势，此时为肌球蛋白溶液中重酶解肌球蛋白（肌球蛋白头部）的变性开始，肌球蛋白头部通过二聚作用开始聚集，在二硫键和非共价键的作用下形成具有弹性的蛋白凝胶网络结构[33]，而50～60 ℃热诱导凝胶储能模量又呈现出下降的现象，此时为酶解肌球蛋白轻链的变性温度，肌球蛋白尾部的解螺旋导致蛋白质的流动性增大，破坏了蛋白质的凝胶网络结构[34]。当温度超过60 ℃时，蛋白质因热变形而展开、折叠、交联，形成不可逆的凝胶网络结构，表现为G’的持续上升[35]。

图5 不同处理方式对肌原纤维蛋白热诱导凝胶G’的影响Fig.5 Effects of different treatments on the storage modulus (G’) of heat-induced MP gels

氧化对照组和其他处理组相比，在第一个拐点处（43 ℃左右）之前，蛋白G’均低于其他处理组，这可能是因为在低温条件下蛋白凝胶结构主要由蛋白质之间的相互作用所影响，而氧化后加速了蛋白质的变性速率，使得蛋白质来不及形成凝胶网络结构，因而在20～43 ℃氧化对照组的G’更低，加入姜黄素后可以促进蛋白质与蛋白质以及姜黄素与蛋白质之间的相互作用，促进了凝胶网络结构的形成。而当温度高于43 ℃后，添加姜黄素的肌原纤维蛋白凝胶的G’高于氧化对照组及空白对照组，同时氧化对照组也高于空白对照组，说明一定的氧化程度有助于蛋白凝胶的形成，可能是因为在一定的氧化条件下会使得蛋白质产生更多的共价键，尤其二硫键的形成有利于蛋白凝胶化[36]，这一研究结果与程镜蓉[25]的研究结果相反，可能是因为研究选择的氧化体系中双氧水浓度不同。但Cao Yungang等[37]指出，在4 ℃ Fenton氧化体系下氧化12 h后，两个转变峰均高于未氧化的空白对照组。于晶超[32]研究了不同双氧水浓度梯度下形成的氧化体系对蛋白热诱导凝胶流变特性的影响，发现低浓度条件下有利于蛋白凝胶的形成，而高氧化强度下会破坏凝胶结构，降低凝胶弹性。肌原纤维蛋白热诱导凝胶G”的变化趋势与G’一致，当加热到50 ℃左右时达到第一个最大峰，从50～65 ℃急剧下降，之后随着温度的升高G”逐渐上升（图6）。整个热诱导加热过程中，G’始终高于G”，说明蛋白热诱导形成的凝胶是一个弹性相对较强的蛋白凝胶[14]。

图6 不同处理方式对肌原纤维蛋白热诱导凝胶G”的影响Fig.6 Effects of different treatments on the loss modulus (G”) of heat-induced MP gels

2.3 肌原纤维蛋白凝胶分子间作用力

蛋白凝胶的形成是一个动态的动力学聚集过程，在这个聚集过程，只有吸引力和排斥力处于平衡状态才能形成保持大量水分在内的高度有序的三维网状结构的蛋白凝胶[38]。一般认为凝胶网络结构的形成是由于蛋白质-蛋白质和蛋白质-水相互作用以及相邻肽键之间的相互吸引力和排斥力相互平衡的结果，形成和维持蛋白凝胶结构的力主要有离子键、氢键、疏水键、二硫键以及非二硫键等作用力[39]。如图7所示，肌原纤维蛋白氧化后，离子键和氢键分别下降了20.97%、28.34%，而疏水性作用力、二硫键和非二硫键则显著性上升了27.36%、45.25%、59.95%（P＜0.05），这主要是因为氧化后蛋白质表面的净电荷数会减少，进而减少其表面的离子强度，蛋白质之间的相互斥力减弱，蛋白质的三级网络结构遭到破坏；其次由于氧化系统中的羟自由基会攻击肌原纤维蛋白的氨基酸侧链，降低氢键的含量[40]；此外，氧化也会导致肌原纤维蛋白表面疏水性的增强和二硫键含量的升高。与氧化对照组进行比较，添加姜黄素都显著性降低了由于氧化带来的负面影响，增强了离子键、氢键的相对含量而降低了表面疏水性、二硫键和非二硫键相对含量。这些可能都与姜黄素的添加中和了氧化体系中羟自由基以及其他部分的自由基因子，缓解了肌原纤维蛋白的氧化相关，说明姜黄素可以较好地缓解肌原纤维蛋白的氧化，同时有利于稳定蛋白质结构，但是从加入姜黄素后的4 个处理组可以看出，姜黄素添加量对蛋白质离子键、氢键、表面疏水性的影响较大而对二硫键和非二硫键的影响较小，这可能是因为前三者的相对含量基数较大。

图7 不同处理方式对肌原纤维蛋白凝胶分子间作用力的影响Fig.7 Effects of different treatments on intermolecular forces of MP gels

2.4 肌原纤维蛋白凝胶微观结构

肌原纤维蛋白的有序聚集形成了凝胶网络结构，通过扫描电子显微镜可以直观地观察出凝胶的微观结构，包括凝胶的三维网状结构，如多孔性、疏松性等，通常情况下凝胶网络结构的致密性和凝胶的保水性有着密切的关系，可以进一步反映出凝胶的特性[34]。如图8所示，空白对照组的凝胶结构呈现出连续的蛋白质网络结构，孔洞较小、结构紧密，而氧化后凝胶结构变得疏松，空隙变大且多，这可能是因为氧化促进了部分蛋白质的交联聚集，破坏了凝胶的网络结构[41]。随着添加姜黄素浓度的增加，肌原纤维蛋白凝胶结构逐渐得到恢复，空隙变小且更加致密，当姜黄素浓度达到15 µmol/L时凝胶结构几乎与空白组无明显差别，这可能是因为姜黄素的加入消耗了氧化体系中了羟自由基，减少了蛋白质的氧化，也有可能是因为姜黄素与肌原纤维蛋白发生了某些交联反应，形成了更加稳定、连续的网络结构，进而具有较强的凝胶强度[42]。同时也可以得出在该研究浓度范围内，高浓度姜黄素有利于凝胶网络结构的形成。

图8 不同处理对凝胶微观结构的影响Fig.8 Effects of different treatments on the microstructure of MP gels

2.5 肌原纤维蛋白凝胶电泳

利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）技术对蛋白氧化及添加姜黄素后所引起的蛋白交联情况进行分析。由图9可知，肌原纤维蛋白中的肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）在非还原条件下氧化12 h后明显减少，且肌动蛋白（Actin）条带变淡，同时浓缩胶顶部颜色明显加深，说明大分子聚集物显著增多，而在还原条件下，绝大多数的MHC得以恢复，且浓缩胶顶部的大分子聚集物大部分消失，这表明由氧化引起的蛋白质交联聚集行为主要是由MHC通过二硫键形成大分子物质引起[17]。

图9 非还原（A）和还原（B）条件下肌原纤维蛋白凝胶SDS-PAGE图Fig.9 SDS-PAGE patterns of MP gels under reducing and nonreducing conditions

在氧化环境中，姜黄素的添加并不能完全阻止蛋白质的聚集，甚至低浓度条件下（5、10 µmol/L姜黄素）与氧化对照组无论是MHC、Actin，还是浓缩胶顶部的聚集情况都相差不大，但是当浓度达到20 µmol/L时，可以清晰看到浓缩胶顶部的聚集物质较少。加入β-巯基乙醇还原后MHC和Actin条带均得到恢复，表明大部分聚合物都是通过二硫键相互作用形成的，同时还原后浓缩胶顶部仍然还有少量的聚集物存在，说明形成的大分子聚集物除了以S—S形式形成外还存在非二硫键。通过SDSPAGE可以看出姜黄素对氧化引起的蛋白质凝胶聚集行为具有一定的改善作用。

2.6 各指标间相关性分析

采用相关性热图分析肌原纤维蛋白凝胶各指标之间的相关程度见图10。结果表明，凝胶白度与保水性和凝胶强度呈负相关，蒸煮损失与凝胶质构各指标影响都呈负相关。另外，凝胶分子间疏水键、二硫键和非二硫键与凝胶保水性、凝胶强度和质构都呈负相关，这说明蛋白凝胶形成过程中，分子间作用力对凝胶网络结构的形成以及凝胶三维网状结构中水分的保持具有重要作用，可作为评价蛋白凝胶形成过程中的动态力学聚集过程。

图10 肌原纤维蛋白凝胶各指标间相关性分析Fig.10 Correlation analysis between indicators of MP gels

3 结论

氧化条件下添加姜黄素可使猪肉肌原纤维蛋白凝胶白度显著降低，促进凝胶强度和保水性的增加以及改善凝胶质构特性，可减缓由氧化而引起的凝胶蒸煮损失的增加；姜黄素的添加可以促进凝胶G’和G”增加；添加姜黄素增加了凝胶蛋白分子间离子键和氢键的相对含量，而降低了表面疏水性、二硫键和非二硫键相对含量；氧化后凝胶微观结构变得疏松、多孔、不结实，而加入姜黄素后凝胶微观结构得到恢复，高浓度姜黄素（15～20 µmol/L）可使肌原纤维蛋白凝胶微观结构恢复至未氧化状态，在一定程度上可以缓解蛋白质由于氧化导致的聚集情况；姜黄素对肌原纤维蛋白凝胶的调控表现为浓度效应，在一定浓度范围内，随着姜黄素浓度的增加，对肌原纤维蛋白凝胶的形成有一定的促进作用，浓度越高更有利于提高肌原纤维蛋白凝胶特性。适量的姜黄素可控制肉品中蛋白质的氧化、提高蛋白凝胶特性，从而增强肉制品的质构特性。