不同粒径硬颗粒饲料养殖克氏原螯虾的投饲策略研究

周 庆，徐晓莹，郭 赛，许巧情，罗 凯，郜卫华，田 娟，陈效儒

(1.长江大学，涝渍灾害与湿地农业湖北省重点试验室，湖北荆州 434025；2.烟台市海洋经济研究院，山东烟台 264003；3.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；4.通威农业发展有限公司，水产健康养殖四川省重点实验室，成都 610041)

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)具有适应性强、养殖周期短、肉质鲜美、营养丰富等优点，是当前最具商业价值的水产品之一。近年来，其全国养殖规模和产量持续快速增长，由2007年的26.55万吨增长到2021年的263.36万吨，增长了8.92倍，年均增长率63.71%[1，2]。然而，目前克氏原螯虾养殖存在规格小、出肉率低等问题，严重影响其经济效益。因此，寻找提高克氏原螯虾生长性能的方法成为产业发展过程中亟待解决的问题。

饲料粒径的大小会影响鱼虾生长性能和饲料效率。BUSTI等[3]分别用2、4和6 mm粒径饲料饲养215.9 g金头鲷(SparusAurata)，结果表明各粒径饲料对金头鲷的终末体重和特定生长率无显著影响，但投喂2 mm粒径饲料能够减少饲料浪费。AGUADO-GIMÉNEZ等[4]采用T1(投喂2 mm粒径饲料至金头鲷达到0.1 kg，然后投喂4 mm粒径饲料)和T2(投喂2 mm粒径饲料至金头鲷达到0.07 kg，随后投喂4 mm粒径饲料至0.22 kg，最后投喂6 mm粒径饲料)两种方式饲养0.05 kg金头鲷，结果表明T2组金头鲷的特定生长率显著提高，同时减少了饲料浪费。ZARZAR等[5]分别用1.7、2.3和3.1 mm粒径饲料饲养军曹鱼(Rachycentroncanadum)，发现3.1 mm组的增重率显著高于1.7 mm组，2.3 mm组的饲料系数显著低于1.7 mm组。与1.0～1.8 mm粒径破碎料相比，投喂1.8 mm粒径颗粒料显著提高了斑节对虾(Penaeusmonodon)幼虾生长速度，提高了饲料效率[6]。AZAZA等[7]分别选用3、7和11 g的尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)开展3个实验，每个实验采用相同的4种不同粒径饲料饲养，结果表明饲料最佳粒径随着尼罗罗非鱼的生长而增大。MATTILA等[8]认为饲料粒径对鱼类生长和饲料效率的影响与鱼类大小有关。因此，不同规格的鱼类，投喂适宜粒径的饲料能够使其生长性能最好。克氏原螯虾生长速度快，特别是早期生长阶段[9]，其个体大小变化快，单一粒径饲料不能满足其快速的生长变化。因此，针对克氏原螯虾幼虾阶段制定多种不同的粒径饲料组合投饲策略是十分有必要的。

在实际养殖生产和科学实验中，多采用2 mm或3 mm粒径的硬颗粒饲料饲喂克氏原螯虾幼虾[10-14]。因此，本实验采用这两种粒径饲料组合投喂，通过改变不同粒径投喂天数以调整投饲策略饲养克氏原螯虾幼虾，研究不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾幼虾生长性能、消化酶活性和非特异性免疫的影响，以期为克氏原螯虾的配合饲料生产与应用及养殖投饵方案提供科学理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

实验饲料(粒径为2 mm和3 mm)由通威股份有限公司提供，饲料营养成分见表1，所有饲料于-20 ℃冰箱储存备用。

表1 实验饲料基本营养成分(干物质)Tab.1 Basic nutrients of experimental feed(dry matter)

1.2 养殖管理

克氏原螯虾幼虾购自湖北省荆州市高清养殖合作社,于长江大学水产基地的半室内循环水系统养殖桶(直径×高=150 cm×50 cm)中暂养14 d。每个养殖桶中放入20根(直径9 cm,长20 cm)PVC水管和塑料仿生水草以供虾苗攀爬和躲避。暂养结束后,饥饿24 h,选取初始体重为(7.73±0.05) g的幼虾随机分配到12个养殖桶中。养殖实验共设置4个处理组,分别为FS1组(3 mm粒径饲料投喂60 d)、FS2组(2 mm粒径饲料投喂10 d和3 mm粒径饲料投喂50 d)、FS3组(2 mm粒径饲料投喂20 d和3 mm粒径饲料投喂40 d)和FS4组(2 mm粒径饲料投喂30 d和3 mm粒径饲料投喂30 d),每组3个重复,每个重复25尾虾,进行为期60 d的养殖。实验期间每天饱食投喂2次(8:00和17:00),每天清除残饵及排泄物,每两天换水1/2。养殖水体水温为(25.0±1.0) ℃,pH7.0±0.5,溶解氧不低于5.0 mg/L,氨氮小于0.1 mg/L。

1.3 样品采集与分析

养殖实验结束后克氏原螯虾禁食24 h，统计养殖桶中克氏原螯虾数量并称重。每桶随机取10尾虾，称量体重和肝胰腺重，用于生长指标的计算。克氏原螯虾血淋巴从围心腔取出，存于1.5 mL的离心管中4 ℃静置4 h后4 ℃离心(14 400g)后取上清液，于-80 ℃保存，用于抗氧化和免疫相关指标的测定。克氏原螯虾肌肉于-20 ℃保存，用于水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的测定。肝胰腺组织于-80 ℃保存，用于抗氧化和免疫相关指标的测定。

1.4 分析方法

饲料水中稳定性测定：参照姚海航等[15]的方法，准确称取10 g饲料，放入尼龙过滤网袋(高30 cm，宽20 cm，孔径0.25 mm)。将网袋置于恒温水浴锅中，水温为(25.0±1.0) ℃，浸泡一定时间(0.5、1、2、4和12 h)后取出网袋，将网袋内饲料置于105 ℃烘箱烘干至恒重(W，g)，另测定未浸泡的饲料水分含量(X，%)。每组设3个重复，水中稳定性用溶失率C表示。各时间段的饲料粗蛋白和粗脂肪含量测定见基本营养成分分析。

基本营养成分分析：饲料中的水分含量采用105 ℃直接干燥法(GB/T5009.3-2010)测定，肌肉水分采用冷冻干燥法(SCIENTZ-10N型冷冻干燥机)测定。粗蛋白采用凯氏定氮法(GB/T5009.5-2016)测定，粗脂肪采用索氏抽提法(GB/T5009.6-2016)测定，灰分采用灼烧称重法(GB/T5009.4-2016)测定。

消化酶活性测定：称取肝胰脏(约0.8 g)，放入10 mL匀浆管中，加入9倍质量的去离子水，用玻璃匀浆器进行冰浴匀浆，4 ℃离心(3 000g) 10 min，取上清待测。使用紫外比色法测定胰蛋白酶(trypsin，TPS)活性，使用甲基试卤灵底物法测定脂肪酶(lipase，LPS)活性，采用淀粉-碘比色法测定淀粉酶(amylase，AMS)活性。所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

血清、肝胰腺抗氧化和免疫相关指标测定：使用磷酸苯二钠法测定酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性。采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用ABTS法测定总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.5 统计分析

计算公式如下：

溶失率(C)=[G(1-X)-W]/[G(1-X)]×100%

增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%

存活率(SR)=Nt/N0×100%

特定生长率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%

饲料系数(FCR)=Wf/(WtNt-W0N0)

肝体比(HIS)=Wh/Wt×100%

含肉率(FC)=Wm/Wt×100%

式中，G为称取的饲料重量(g)；X为饲料含水率(%)；W为烘干后网袋内饲料重量(g)；Wt为终末体重(g)；W0为初始体重(g)；Lt为终末体长(cm)；Nt为终末尾数；N0为初始尾数；t为实验天数(d)；Wf为饲料摄入量(g)；Wd为死亡总重(g)；Wh为肝胰腺重(g)；Wm为虾尾部肌肉重(g)。

实验结果用平均值±标准误(mean±standard error)表示。采用SPSS 26.0软件进行独立样本t检验和单因素方差分析(One-way ANOVA)，Tukey法进行多重比较，当P<0.05时，表示差异显著。

2 结果

2.1 饲料的水稳定性、粗蛋白和粗脂肪含量变化情况

由表2可知，两种粒径饲料随着在水中浸泡时间的延长，饲料溶失率显著增大。浸泡0.5、1、2、4和12 h时，3 mm粒径饲料溶失率极显著低于2 mm粒径饲料。由表3可知，随着在水中浸泡时间的延长，2 mm粒径饲料粗蛋白含量总体呈现上升趋势，在12 h时，粗蛋白含量最大，且显著高于其他检测时间段。随着在水中浸泡时间的延长，3 mm粒径饲料粗蛋白含量显著增加，在12 h时，粗蛋白含量最大。浸泡0.5、1、2、4和12 h时，2 mm粒径饲料粗蛋白含量极显著低于3 mm粒径饲料。由表4可知，两种粒径饲料随着在水中浸泡时间的延长，饲料粗脂肪含量总体呈现降低趋势，2 mm粒径饲料粗脂肪含量在浸泡12 h时显著降低，3 mm粒径饲料在浸泡4 h和12 h时显著降低。在浸泡0.5 h、1 h和2 h时，两种粒径饲料粗脂肪含量无显著差异，在浸泡4 h和12 h时，3 mm粒径饲料粗脂肪含量显著低于2 mm粒径饲料。

表2 不同时间两种粒径饲料的溶失率(干重)Tab.2 Dissolution rate of feed with two particle sizes at different times(dry matter)

表3 不同时间两种粒径饲料的粗蛋白含量变化(干重)Tab.3 Change in crude protein content of feed with two particle sizes at different times(dry matter)

表4 不同时间两种粒径饲料的粗脂肪含量变化(干重)Tab.4 Changes in crude lipid content of two particle sizes of feed at different times(dry matter)

2.2 不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾生长性能的影响

由表5可知，各组间存活率、肝体比、肥满度和腹部含肉率均无显著差异。增重率和特定生长率均呈现先升高后降低的趋势，且最大值均出现在FS2组，并显著高于FS4组。FS2组、FS3组和FS4组的饲料系数显著低于对照组(FS1)。

表5 不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾生长性能的影响Tab.5 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on growth performance of P.clarkii

2.3 不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肌肉基本成分的影响

由表6可知，不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肌肉的水分、粗蛋白和灰分含量均无显著影响。随着投喂2 mm粒径饲料的天数占比增加，克氏原螯虾肌肉粗脂肪含量逐渐降低，且FS1组显著高于FS4组。

表6 不同饲料粒径投饲策略对克氏原螯虾腹部肌肉成分的影响Tab.6 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on abdominal muscle composition of P.clarkii %

2.4 不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肝胰腺消化酶活性的影响

由表7可知，不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肝胰腺中AMS和LPS活性均无显著影响。TPS活性呈现先升高后下降的变化趋势，其活性在FS2组最高，且显著高于FS4组。

表7 不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肝胰腺消化酶活性的影响Tab.7 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on hepatopancreas digestive enzymes activities of P.clarkii U/mg prot

2.5 不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肝胰腺和血清抗氧化相关指标和非特异性免疫酶活性的影响

由表8可知，不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肝胰腺中ACP、AKP活性和T-AOC均无显著影响。FS3组的肝胰腺SOD活性显著高于FS1组。FS2组和FS4组的肝胰腺MDA含量均显著低于FS1组。由表9可知，不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾血清的T-AOC、SOD、AKP、ACP活性和MDA含量均无显著性差异。

表8 不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化相关指标和非特异性免疫酶活性的影响Tab.8 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on hepatopancreas antioxidant related indicators and non-specific immune enzyme activity of P.clarkii

表9 不同粒径硬颗粒饲料对克氏原螯虾血清抗氧化相关指标和非特异性免疫酶活性的影响Tab.9 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on serum antioxidant related indicators and non-specific immune enzyme activity of P.clarkii

3 讨论

颗粒饲料的水稳定性是评价水产饲料质量的重要参数[15]。克氏原螯虾因其具有特殊的摄食行为，导致进食过程缓慢，因此对饲料的水稳定性要求更高。一般认为饲料粒径越小，水稳定性越差，越容易被水浸润，易溶成分就越容易溶失在水中，难溶成分就越容易因饲料破碎剥落而散失在水中[5，6，16-18]。本实验中，与3 mm粒径饲料相比，2 mm粒径饲料溶失率更高，浸泡过程中，粗蛋白含量更低，水稳定性更差，结果符合上述规律。在浸泡2 h内时，两种粒径饲料粗脂肪含量无显著差异，说明两种粒径饲料粗脂肪的水稳定性在2 h内不受粒径大小的影响。随着浸泡时间的延长，粗蛋白含量增加，这可能是因为蛋白质难溶于水，而饲料中可溶物质溶出速度快，相比之下，随着浸泡时间延长，饲料中蛋白总量减少，但蛋白含量增加，这与朱金林[18]的结果相同。

一些鱼类研究发现，饲料粒径大小和鱼类生长的关系遵循二次曲线模型[8]。研究表明在金头鲷[4]、彭泽鲫(Carassiusauratusvarpengze)[19]、梭子鱼(Sanderlucioperca)[8]、尼罗罗非鱼[7]和非洲鲶(Clariasgariepinus)[20]等鱼类的生长性能随着饲料粒径大于或者小于最佳饲料粒径而降低。本实验的4种粒径组合投饲策略中，FS2组的克氏原螯虾的增重率和特定生长率最高。表明单一粒径饲料(3 mm)无法满足克氏原螯虾幼虾阶段(7.62～17.40 g)的生长需求，适宜的饲料粒径组合投喂有助于促进克氏原螯虾幼虾的生长。与其它组相比，FS2组的饲料粒径组合更加接近克氏原螯虾幼虾阶段生长变化所需的最佳饲料粒径。在饱食投喂的情况下，饲料粒径主要通过捕获及摄入难易程度、表面积大小和胃肠排空速率等因素影响鱼类生长，当饲料粒径较小时，饲料表面积大，溶失率较高，营养成分溶失[5]。饲料小粒径加快了胃肠排空速率，导致消化和吸收时间减少，降低消化效率[3，5，7]。同时鱼类需要消耗更多的能量，以获得与投喂较大粒径饲料相同的摄入量[3-5]。但另一方面而言，小粒径饲料与消化酶接触的表面积更大，浸润所需时间更短，有助于提高消化效率[5，7，21]。较大粒径饲料则相反，因此饲料粒径大小需要平衡影响生长的各种因素，从而达到最佳饲料粒径。一般而言，随着鱼虾的生长，口、胃肠道等摄食或消化器官逐渐变大，最佳饲料粒径可能也在增大[8，19]。因此，养殖过程中需要适时调整投喂饲料粒径，以适应鱼虾的生长。在本研究中，FS2组的饲料粒径组合比其他组更好，顺应了克氏原螯虾在不同生长阶段的变化，从而使营养溶失情况、食物消化和能量消耗等方面相互协调达到相对较好水平，最终促进克氏原螯虾的生长。虽然克氏原螯虾摄食行为为抱食，会影响饲料到达消化道的实际粒径大小，但与克氏原螯虾一样具有特殊摄食行为(咀嚼)的金头鲷，其胃肠排空速率也会受到饲料粒径大小的影响[3]。因此，不同粒径的饲料进入克氏原螯虾消化道后仍然存在粒径差异。

分析饲料粒径大小导致的饲料系数差异不同于营养元素研究实验，不仅要关注其对生长的影响，还需要考虑饲料浪费情况[5]。FS1组和FS4组饲料系数比FS2组和FS3组高，这可能是FS1组所用的3 mm粒径饲料对于饲养前期的克氏原螯虾幼虾来说，粒径过大，抱食过程中产生很多饲料碎片，造成饲料浪费[22]。FS4组所用的2 mm粒径饲料，随着克氏原螯虾的生长，其粒径相对变小，捕获并被摄食的概率降低或花费时间变长，导致饲料溶失增多，造成了饲料浪费[5]。同时该组增重较其它组低，致使饲料系数升高。本实验结果表明，FS1组和FS2组饲料粒径组合较为适中，减少了饲料浪费，提高了饲料效率。

消化酶与水产动物生长密切相关，消化酶活性高低会直接影响水产动物对营养物质的消化吸收，从而影响生长[23]。本实验中，各组肝胰腺脂肪酶活性无显著差异，这可能是克氏原螯虾摄入的两种粒径饲料粗脂肪含量无显著差异引起的。随着2 mm小粒径饲料投喂天数的占比逐渐增加，腹部肌肉粗脂肪含量逐渐下降，可能是由于各组间克氏原螯虾肝胰腺脂肪酶无显著差异，而小粒径饲料在胃肠的排空速率快，降低了消化效率[3，5，7]，随着克氏原螯虾的生长，饲料粒径相对变得更小，进一步加剧降低了对脂肪的利用能力，另外摄入小粒径饲料消耗的能量更多[3-5]，最终导致克氏原螯虾腹部肌肉粗脂肪含量逐渐降低。胰蛋白酶活性呈现先升高后降低的趋势，在FS2组最强，表明适宜的粒径组合提高了克氏原螯虾幼虾阶段肝胰腺胰蛋白酶的活性，从而提高其对蛋白质的消化利用，进而促进了克氏原螯虾的生长，而其作用机制有待进一步研究。

克氏原螯虾的非特异性免疫和抗氧化能力是维持机体良好生长的必要因素之一[24-26]。抗氧化酶是抵抗活性氧损伤的第一道防线[27]，SOD可以清除过量的活性氧，在克氏原螯虾的抗氧化及免疫系统中起着重要作用[28]。MDA是脂质过氧化产物，能够反映机体组织器官脂质过氧化损伤程度[29]。肝胰腺是虾体的代谢中心器官，极易受到自由基的攻击，导致氧化损伤[28]。本实验发现，投喂两种粒径(2 mm和3 mm)饲料各组肝胰腺的SOD活性均高于单一粒径饲料组，且FS3组显著高于FS1组。两种粒径饲料组合投喂组(FS2组和FS4组)肝胰腺的MDA含量显著低于单一粒径饲料组(FS1组)。表明在单一粒径饲料(3 mm)投饲策略下，克氏原螯虾幼虾阶段抗氧化能力较弱，适宜饲料粒径组合(FS3组)投喂有助于提高克氏原螯虾幼虾肝胰腺的SOD活性，同时适宜饲料粒径组合(FS2组和FS4组)可以降低MDA含量，减少抗氧化损伤。其作用机制有待进一步研究。ACP是巨噬细胞中溶酶体的标志性酶，在机体的免疫应答中发挥重要作用[23]。AKP是鱼虾体内重要的代谢调节酶，在鱼虾营养物质的吸收和利用中起着重要作用，可提高虾蟹的抗病能力[27]。克氏原螯虾缺乏特异性免疫系统，只能依靠非特异性免疫来抵抗病原体的入侵[30]，其中包括ACP和AKP，两者常用于评估克氏原螯虾免疫能力。本研究发现，不同粒径硬颗粒饲料投饲策略对克氏原螯虾肝胰腺和血清的ACP和AKP活性没有显著影响。结果表明，克氏原螯虾免疫能力不受不同粒径硬颗粒饲料投饲策略的影响。

4 结论

单一的粒径饲料投饲策略不能很好满足克氏原螯虾幼虾阶段快速生长变化需求。适宜的饲料粒径组合投饲策略，能够提高克氏原螯虾消化酶活性，增强机体的抗氧化能力，促进生长，降低饲料系数。根据本实验结果综合考虑，FS2组的饲料粒径组合投饲策略更有利于克氏原螯虾幼虾阶段的生长，因此，建议此阶段克氏原螯虾的硬颗粒饲料投饲策略为2 mm粒径饲料投喂10 d和3 mm粒径饲料投喂50 d。