耳甲电针疗法对CUMS诱导抑郁症大鼠的治疗作用及其机制

毛树文，宗成翠，孙付军，赵新芝

1 山东中医药大学附属医院推拿科，济南 250014；2 沂水县人民医院康复科；3 山东省中医药研究院药理研究所

抑郁症是一种常见的精神障碍，主要症状为情绪紊乱、快感缺乏、认知功能障碍等［1-2］。预计到2030年，抑郁症将成为全球第一大负担疾病［3］。抑郁症可严重影响患者日常生活和社会功能。虽然抗抑郁药物（如氟西汀）能够在一定程度上缓解抑郁症状，但仍有约三分之一患者治疗反应不佳，并且长期用药可能会引起一系列不良反应。因此，探索高效低毒的抑郁症治疗方案具有重要意义。耳甲电针疗法是治疗抑郁症的一种替代性方法，可改善抑郁症状且不良反应较少。但目前耳甲电针疗法治疗抑郁症的作用机制尚未完全阐明。有研究报道，蛋白激酶A（PKA）/环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）信号通路异常与抑郁症的发生密切相关［4］。HOU等［5］研究证实，电针疗法能够刺激PKA/CREB 信号通路，而耳甲电针疗法是否通过刺激该信号通路发挥抗抑郁作用尚不清楚。2021 年5 月—2022 年12 月，本研究观察了耳甲电针疗法对慢性不可预知温和应激（CUMS）诱导抑郁症大鼠的治疗作用及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 成年雄性SD 大鼠24 只，SPF 级，6 周龄，体质量（220 ± 20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物合格证号：SCXK（鲁）20190003。饲养环境：温度23～26 ℃，相对湿度（50 ± 10）%，光照12 h/12 h 明暗交替，保持通风。本研究经山东中医药大学附属医院动物伦理委员会批准（批件号：2022-0567）。盐酸氟西汀分散片，购自山东力诺制药有限公司；异氟烷麻醉剂，购自深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司。无菌针灸针，购自苏州环球针灸医疗器械有限公司；电子针疗仪，购自南京贝登医疗股份有限公司；小动物麻醉机，购自深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司；全波长酶标仪，购自美国Thermo Fisher Scientific公司。蛋白激酶A-α（PKA-α）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、磷酸化CREB（p-CREB）、GAPDH 一抗，购自美国Cell Signaling Technology 公司；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物分组干预 SD 大鼠分笼饲养，自由摄食、饮水。适应性饲养7天，随机分为对照组、模型组、氟西汀组、耳甲电针组，每组6只。对照组正常群养，每日灌胃生理盐水2 mL，不予特殊干预，连续35天。模型组、氟西汀组、耳甲电针组孤养，均予CUMS 暴露35 天。CUMS 暴露［6］：每日随机进行冷水游泳（4 ℃5 min）、夹尾（3 min）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、潮湿垫料（24 h）、昼夜颠倒（12 h/12 h）中的一项刺激，同一种刺激不可连续使用。氟西汀组实验第14 天开始在CUMS暴露前2 h予1 mg/mL盐酸氟西汀10 mg/kg灌胃，每日1次，连续21天；耳甲电针组实验第14天开始在CUMS暴露前2 h，异氟烷麻醉后予电针刺激双侧耳甲神门穴，刺激强度2 mA、频率20 Hz，每日1 次，每次30 min，连续21 天。SD 大鼠出现糖水消耗量、体质量、活动量明显下降，即为建模成功。

1.3 抑郁相关指标观察

1.3.1 体质量 实验前和实验第14、35 天，使用电子台秤称量大鼠体质量。

1.3.2 自发活动行为和探索行为 实验前和实验第14、35天，通过旷场实验观察大鼠自发活动行为和探索行为。旷场装置由一个长80 cm × 宽80 cm × 高40 cm的箱体组成，内壁涂黑，底面平均分成25 个16 cm ×16 cm黑白相间的正方形格子，正上方固定数码相机，视野覆盖旷场内部。将每只大鼠置于箱体底部中央，自由运动5 min，记录穿越格子数和站立次数。穿越格子数越多，表明自发活动行为越多。站立次数越多，表明对环境的好奇心越强，探索行为越活跃。

1.3.3 快感缺失行为 实验前和实验第14、35 天，通过糖水偏好实验评估大鼠快感缺失行为。实验前对大鼠进行2天糖水适应训练，实验前1天禁食禁水23 h。随后置于笼内孤养，笼内放置两个分别装有150 mL 1%蔗糖溶液和150 mL纯水的瓶子。1 h后，称量两个瓶子的质量，记录糖水和纯水的消耗量，计算糖水偏好指数。糖水偏好指数=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%。

1.4 PKA/CREB 信号通路蛋白表达检测 实验第35 天，其他测试结束后断头取脑，分离海马组织，-80 ℃冰箱保存。采用RIPA 裂解液提取组织总蛋白，经BCA 法蛋白定量合格。然后加入5 × 蛋白上样缓冲液，100 ℃金属浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白20 µg，SDS-PAGE 分离。电泳结束，将蛋白电泳产物电转印至PVDF膜上。1 × TBST室温封闭，然后分别加入PKA-α（稀释比1∶2 000）、p-CREB（稀释比1∶500）、CREB（稀释比1∶500）、GAPDH（稀释比1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比1∶2 000），室温孵育60 min。ECL发光，暗室内曝光、显影、定影。采用Image J 软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料服从正态分布且方差齐性，以xˉ ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间体质量比较 见表1。

表1 各组不同时间体质量比较（g，± s）

表1 各组不同时间体质量比较（g，± s）

注：与对照组同期比较，*P＜0.05；与模型组同期比较，#P＜0.05。

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2.2 各组不同时间自发活动行为和探索行为比较 见表2。

表2 各组不同时间自发活动行为和探索行为比较（± s）

表2 各组不同时间自发活动行为和探索行为比较（± s）

注：与对照组同期比较，*P＜0.05；与模型组同期比较，#P＜0.05。

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2.3 各组不同时间快感缺失行为比较 见表3。

表3 各组不同时间快感缺失行为比较（± s）

表3 各组不同时间快感缺失行为比较（± s）

注：与对照组同期比较，*P＜0.05；与模型组同期比较，#P＜0.05。

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2.4 各组海马组织PKA/CREB 信号通路蛋白表达比较 见表4。

表4 各组海马组织PKA-α、CREB、p-CREB蛋白相对表达量比较（± s）

表4 各组海马组织PKA-α、CREB、p-CREB蛋白相对表达量比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

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3 讨论

近年来，随着社会经济快速发展，人们的生活节奏逐渐加快，工作压力日益增大，由此导致的精神心理问题越来越多。抑郁症是一种全球性的精神疾病，其发病率呈逐年上升趋势，预计到2030年，将成为全球第一大负担疾病［3］。抑郁症不仅会影响患者的日常生活、工作和学习，还会影响患者的心理健康，导致情绪持续低落、兴趣丧失，继而引起一系列身体症状，如睡眠障碍、食欲改变［7］。氟西汀是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，是目前治疗抑郁症的一线药物之一。氟西汀可通过抑制5-羟色胺的再摄取来增加突触间隙的5-羟色胺浓度，从而发挥抗抑郁作用。但长期应用氟西汀会出现性功能障碍、胃肠道不适等不良反应，并且约三分之一的抑郁症患者对氟西汀治疗无反应。这些问题限制了氟西汀的临床应用，部分抑郁症患者因无法耐受而中途停药。因此，寻找高效低毒的抑郁症治疗方案具有重要意义。

中医认为，耳与经络脏腑有着密切联系，六经虽然不直接于耳，但能通过阳经与耳联系，其病理生理过程也经此传达至耳。临床研究证实，耳针疗法对抑郁症有一定临床疗效，其治疗抑郁症的耳穴均分布于耳甲的迷走神经分布区域［8］。2005年美国FDA批准迷走神经刺激疗法用于治疗难治性抑郁症［9］。有研究发现，接受迷走神经刺激疗法的抑郁症患者脑脊液中γ-氨基丁酸的总水平和游离水平显著升高，而谷氨酸水平显著降低，这可能是其治疗机制之一［10］。耳甲电针能够激活耳甲腔和外耳道的迷走神经末梢，其传入纤维到达下神经节的假单极神经元，经传入神经纤维向内传入孤束核，而孤束核可与诸多脑区发生联系。因此，耳甲电针疗法对情志疾病具有独特优势，如疗效好、费用低、不良反应少等。但目前耳甲电针疗法的作用机制仍不十分清楚。

本研究通过CUMS 诱导抑郁症大鼠模型，基于PKA/CREB信号通路探索了耳甲电针疗法对抑郁症的作用机制。本研究结果发现，模型组实验第14天与第35天体质量、自发活动行为和探索行为以及糖水偏好指数均显著低于对照组同期，提示抑郁症模型构建成功。本研究结果发现，耳甲电针组和氟西汀组实验第35天体质量显著高于模型组同期，说明耳甲电针和氟西汀治疗后均能抑制大鼠体质量降低；耳甲电针组和氟西汀组实验第35天自发活动行为和探索行为均显著高于模型组同期，说明耳甲电针和氟西汀治疗后均能改善抑郁样行为；耳甲电针组和氟西汀组实验第35 天糖水偏好指数均显著高于模型组同期，说明耳甲电针和氟西汀治疗后均能显著增强大鼠对糖水奖赏的敏感性。耳甲电针组与氟西汀组体质量、自发活动行为和探索行为以及糖水偏好指数比较差异均无统计学意义。表明耳甲电针和氟西汀治疗抑郁症大鼠的效果相当。

已有研究证实，PKA/CREB 信号通路能够参与调节突触可塑性和学习记忆，该信号通路的系统性扰动可引起抑郁症神经病理学的级联反应，包括区域大脑活动异常、突触功能改变和神经损伤［11-13］。PKA是一种cAMP依赖性蛋白激酶，能够磷酸化多种底物蛋白，从而调节细胞内的信号传导。CREB是一种受cAMP 和Ca2+调节的转录因子，能够参与大脑发育、神经元存活和神经发生。在抑郁症患者及动物模型中，PKA/CREB信号通路的活性通常受到抑制，导致海马区神经元的兴奋性和突触可塑性降低。PKA催化亚基解离，入核后磷酸化CREB，p-CREB 进一步参与机体神经元生长、神经保护、细胞修复、记忆功能等［14］。本研究结果发现，模型组海马组织PKA-α、p-CREB蛋白相对表达量均显著低于对照组；氟西汀组和耳甲电针组海马组织PKA-α、p-CREB蛋白相对表达量均显著高于模型组，但氟西汀组与耳甲电针组海马组织PKA-α、p-CREB蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义。结果表明，抑郁症大鼠海马组织PKA-α 和p-CREB 蛋白表达下调，而耳甲电针和氟西汀治疗则可上调海马组织PKA-α 和p-CREB 蛋白表达，并且耳甲电针与氟西汀的治疗效果相当。

综上所述，耳甲电针疗法能够改善CUMS诱导抑郁症大鼠抑郁样行为，其效果与氟西汀相当；激活海马组织PKA/CREB信号通路可能是其作用机制之一。