基于Fas/FasL 信号通路探索舒芬太尼对急性心肌梗死大鼠心功能和心肌细胞凋亡的影响

金成浩，元顺女，朴龙一

首都医科大学附属北京同仁医院麻醉科，北京100730

急性心肌梗死（AMI）是一种常见的心血管疾病，具有高发病率和高病死率的特点［1］。AMI 发生后，由于缺血、缺氧，局部心肌组织坏死，大量心肌细胞凋亡，触发炎症反应，促进心肌纤维化，最终导致心脏重构和心力衰竭［2］。因此，抑制或减少心肌细胞凋亡能够阻止AMI 后的心脏重构并改善心功能。脂肪酸合成酶（Fas）/脂肪酸合成酶配体（FasL）信号通路是细胞凋亡的重要通路，抑制该信号通路激活可抑制心肌细胞凋亡［3］。舒芬太尼属于µ型阿片受体激动剂，是一种强效的阿片类镇痛药，常用于心脏手术的辅助麻醉和麻醉诱导。有研究报道，舒芬太尼对心肌缺血再灌注损伤具有心脏保护作用，可缩小心肌缺血再灌注所致的心肌梗死面积［4］。但舒芬太尼是否通过调控Fas/FasL 信号通路影响心功能和心肌细胞凋亡，目前尚不清楚。2022 年10 月—2023 年6 月，本研究基于Fas/FasL 信号通路探索了舒芬太尼对AMI 大鼠心功能和心肌细胞凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD 大鼠108 只，清洁级，8 周龄，体质量（200 ± 20）g，购自中国科学院上海药物研究所，动物生产许可证号：SCXK（沪）2020-0005。所有SD 大鼠于SPF 级动物房内分笼饲养，自由摄食和饮水。饲养环境：温度18～26 ℃，相对湿度55%～60%，光照12 h/12 h明暗交替，正常通风。本研究经首都医科大学附属北京同仁医院动物伦理委员会批准（批件号：20220401）。舒芬太尼，购自宜昌人福药业有限责任公司。Fas shRNA 慢病毒和NC shRNA慢病毒，购自山东维真生物科技有限公司。DM IL LED 型荧光显微镜，购自德国Leica 公司；SuPerMax 3000FL 型多功能酶标仪，购自上海闪谱生物科技有限公司。TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；Bcl-2、Bax 一抗，购自美国CST 公司；Caspase-3 一抗，购于美国Santa Cruz Biotechnology 公司；GAPDH 一抗及辣根过氧化酶标记的二抗，购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 动物分组与干预 所有SD 大鼠适应性饲养7天，随机分为对照组、模型组、舒芬太尼低剂量组、舒芬太尼高剂量组、舒芬太尼高剂量 + Fas 阴性对照组、舒芬太尼高剂量 + Fas慢病毒组，每组18只。模型组、舒芬太尼低剂量组、舒芬太尼高剂量组、舒芬太尼高剂量 + Fas 阴性对照组、舒芬太尼高剂量 +Fas 慢病毒组通过冠状动脉左前降支结扎法制作AMI 模型［5］，对照组除不结扎冠状动脉左前降支外，其余步骤与AMI 模型相同。结扎成功后，肉眼可见结扎区域以下组织苍白或发绀，搏动减弱，心电图出现ST 段持续抬高，即AMI 模型制作成功。舒芬太尼低剂量组和舒芬太尼高剂量组分别于AMI 模型制作成功后24 h 腹腔注射0.1、1 µg/kg舒芬太尼［6］。舒芬太尼高剂量 + Fas 阴性对照组和舒芬太尼高剂量 + Fas 慢病毒组分别于AMI 模型制作成功后24 h 腹腔注射1 µg/kg 舒芬太尼和尾静脉注射200 nmol/kg NC shRNA 慢病毒或Fas shRNA 慢病毒。对照组和模型组均腹腔注射等量生理盐水。

1.3 血清肌钙蛋白T 检测 术后72 h，采集大鼠尾静脉血1 mL，2 000 r/min 离心10 min、离心半径10 cm，留取上层血清，采用ELISA 法检测血清肌钙蛋白T。

1.4 心功能检测 术后72 h，采用超声心动图检测大鼠在3 个连续心动周期中左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）、左心室舒张末期内径（LVEDd）和左心室收缩末期内径（LVESd）。

1.5 血清TNF-α、IL-6 检测 待大鼠心功能检测完成后，腹主动脉取血，2 000 r/min 离心10 min、离心半径10 cm，留取上层血清。采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6。

1.6 心肌梗死面积检测 待大鼠采血结束，断头处死，留取心脏。随机选择6 只大鼠的心脏组织，常规固定、包埋、切片。将切片置于2% TTC 溶液中，37 ℃染色30 min，4%多聚甲醛固定后拍照。采用Image J 软件分析心肌梗死面积和整个心肌横断面面积，计算心肌梗死部分占心肌横断面面积的百分比。

1.7 心肌组织病理形态观察 随机选择6 只大鼠的心脏组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，脱水、透明，中性树胶封固。光学显微镜下观察心肌组织病理形态变化。

1.8 细胞凋亡检测 取上述石蜡切片，二甲苯透明，梯度乙醇脱水，漂洗后加入蛋白酶K 工作液，再次漂洗后加入TUNEL 检测液50 µL，37 ℃避光孵育1 h。然后滴加DAPI 避光染核10 min，封片液封片。荧光显微镜下拍照计数，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=TUNEL 阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.9 细胞凋亡及Fas/FasL 信号通路相关蛋白表达检测 取剩余6 只大鼠的心脏组织，液氮下研磨成粉末，加入预冷的RIPA 裂解液冰上裂解，提取组织总蛋白，经BCA 法蛋白定量合格。加入1 × 蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴充分变性。取部分变性蛋白，SDS-PAGE 分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas、FasL、GAPDH 一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。ECL 发光，暗室内曝光、显影、定影。凝胶成像系统成像，Image J 软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。正态分布的计量资料以xˉ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后多重比较采用LSD-t检验；两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌损伤程度和心功能比较 见表1。

表1 各组血清肌钙蛋白T水平以及LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd比较（± s）

表1 各组血清肌钙蛋白T水平以及LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与舒芬太尼低剂量组比较，△P＜0.05；与舒芬太尼高剂量 + Fas阴性对照组比较，▲P＜0.05。

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2.2 各组血清TNF- α、IL-6 水平比较 见表2。

表2 各组血清TNF-α、IL-6水平比较（pg/mL，± s）

表2 各组血清TNF-α、IL-6水平比较（pg/mL，± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与舒芬太尼低剂量组比较，△P＜0.05；与舒芬太尼高剂量 + Fas阴性对照组比较，▲P＜0.05。

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2.3 各组心肌梗死面积占比比较 对照组、模型组、舒芬太尼低剂量组、舒芬太尼高剂量组、舒芬太尼高剂量 + Fas 阴性对照组、舒芬太尼高剂量 + Fas慢病毒组心肌梗死面积占比分别为0、（32.54 ±3.26）%、（23.58 ± 2.41）%、（8.63 ± 0.86）%、（9.14 ±0.91）%、（27.66 ± 2.77）%。与对照组比较，模型组心肌梗死面积增大（P＜0.05）。与模型组比较，舒芬太尼低剂量组、舒芬太尼高剂量组心肌梗死面积减小，并且以舒芬太尼高剂量组心肌梗死面积减小较为明显（P均＜0.05）。与舒芬太尼高剂量 + Fas阴性对照组比较，舒芬太尼高剂量 + Fas慢病毒组心肌梗死面积增大（P＜0.05）。

2.4 各组心肌组织病理形态观察 对照组心肌细胞形态规则，心肌纤维排列整齐，无明显水肿和炎性细胞浸润。与对照组比较，模型组心肌细胞形态模糊、纹理消失、排列紊乱、心肌间小血管扩张、细胞数量减少，可见大量炎性细胞浸润。与模型组比较，舒芬太尼低剂量组和舒芬太尼高剂量组心肌细胞形态、纹理、排列、血管扩张、细胞数量及炎性细胞浸润显著改善，并且以舒芬太尼高剂量组改善较为明显。舒芬太尼高剂量 + Fas 阴性对照组心肌细胞形态相对规则，心肌纤维排列相对整齐，水肿和炎性细胞浸润较轻。与舒芬太尼高剂量 + Fas 阴性对照组比较，舒芬太尼高剂量 + Fas 慢病毒组心肌细胞形态模糊、纹理消失、排列紊乱、心肌间小血管扩张、细胞数量减少，炎性细胞浸润明显。

2.5 各组心肌细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白表达比较 见表3。

表3 各组心肌细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白表达比较（± s）

表3 各组心肌细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白表达比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与舒芬太尼低剂量组比较，△P＜0.05；与舒芬太尼高剂量 + Fas阴性对照组比较，▲P＜0.05。

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2.6 各组心肌细胞Fas/FasL 信号通路相关蛋白表达比较 见表4。

表4 各组心肌细胞Fas、FasL蛋白相对表达量比较（± s）

表4 各组心肌细胞Fas、FasL蛋白相对表达量比较（± s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与舒芬太尼低剂量组比较，△P＜0.05；与舒芬太尼高剂量 + Fas阴性对照组比较，▲P＜0.05。

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3 讨论

AMI 是一种临床常见的心血管疾病，在世界范围内具有高发病率和高病死率的特点。AMI的主要表现为心肌大面积坏死、心肌收缩力减弱，从而导致供血不足及其他恶性并发症的发生。尽管人们在开发新型心脏保护剂方面付出了巨大努力，但成果并不理想，迫切需要阐明AMI 的分子机制，以开发新的治疗策略。

AMI发生后，心脏的泵血功能会受到影响，主要原因为心肌细胞缺血缺氧而发生坏死，导致心肌收缩力减弱，心脏射血功能降低，进而影响全身血液供应。肌钙蛋白T是AMI发生后心肌损伤的生物标志物。LVEF、LVFS、LVEDd、LVESd 主要反映心脏的收缩和舒张功能。有研究报道，在连续心动周期中，若出现LVEF、LVFS降低，LVEDd、LVESd升高，则提示大鼠心功能出现异常［7］。本研究结果发现，AMI大鼠血清肌钙蛋白T 水平升高，LVEF、LVFS 降低，LVEDd、LVESd 升高，与既往的研究［7］结果一致，表明AMI 大鼠出现了心功能损伤。AMI 发生后，先天免疫反应被激活，大量炎性细胞因子被释放，过度炎症反应会导致心肌形成大量瘢痕组织和纤维化，引起心室重塑，最终影响心功能。其中，TNF-α、IL-6参与炎症反应，并在AMI 发生后水平升高。有研究报道，大鼠AMI 发生后心肌细胞中TNF-α、IL-6 含量升高，抑制TNF-α、IL-6 则可对AMI 大鼠的心肌细胞起到保护作用［8］。此外，过度的炎症反应会引起心肌细胞凋亡，而心肌细胞是不可再生细胞，过度凋亡会被纤维组织及成纤维细胞取代，从而破坏心肌的结构和功能。有研究报道，抑制AMI 大鼠心肌细胞凋亡能够显著改善心功能，阻止心肌损伤［9］。细胞凋亡过程受多种基因的共同调控，Bax 是促进凋亡基因，Bcl-2 是抑制凋亡基因［10］。Caspases 家族在细胞凋亡过程中发挥重要作用，Caspase-3 是Caspase级联反应下游最关键的促凋亡蛋白，是凋亡的关键执行分子［11］。有研究显示，促进Bcl-2 表达、抑制Bax 表达能够在一定程度上减轻心肌细胞凋亡，有助于改善左心室功能以及减轻心室重塑［12］。本研究结果显示，模型组血清TNF-α、IL-6 水平和心肌细胞凋亡率以及Bax、Caspase-3 蛋白表达上调，Bcl-2 蛋白表达下调，提示AMI 发生后可引起炎症反应和心肌细胞凋亡。

阿片类麻醉剂在AMI 动物模型中具有心肌保护作用，不仅能缓解心肌梗死症状、减少心肌梗死面积、减轻心肌缺血损伤，还能改善心脏微循环障碍，促进心功能恢复。舒芬太尼是一种在心血管手术中广泛应用的新型µ型阿片受体激动剂，具有良好的镇痛效果。此外，舒芬太尼的血流动力学稳定，可发挥心脏保护作用［13］。据报道，舒芬太尼可抑制缺氧复氧诱导的H9C2 细胞凋亡和自噬［14］。舒芬太尼能够提高缺血再灌注心肌细胞的增殖活性，降低细胞凋亡率［15］。本研究结果显示，舒芬太尼可降低AMI大鼠血清肌钙蛋白T 水平，升高LVEF、LVFS，降低LVEDd、LVESd和心肌梗死面积，表明舒芬太尼能够改善AMI大鼠心功能。此外，舒芬太尼干预后，AMI大鼠血清TNF-α、IL-6 水平和心肌细胞凋亡率以及Bax、Caspase-3 蛋白表达降低，Bcl-2 蛋白表达升高，提示舒芬太尼可抑制AMI 大鼠心肌炎症反应和心肌细胞凋亡，具有心脏保护作用。

Fas/FasL信号通路是介导细胞凋亡的一条重要途径，该信号通路可促进炎性细胞因子分泌，激发炎症反应，从而参与免疫逃逸、肿瘤形成和转移等过程［16］。Fas 是一种典型的死亡受体，而FasL 是结合Fas 的Ⅱ型膜蛋白，两者均属于肿瘤坏死因子家族。Fas 与FasL 的相互作用可导致pro-Caspase-8 裂解激活Caspase-8，再通过介导的Caspase 级联反应激活Caspase-3，从而诱导细胞凋亡。FasL 介导的细胞凋亡与多种病理生理过程密切相关。AMI 发生后，心肌细胞因缺血缺氧而坏死，这可能触发了Fas/FasL信号通路的激活，一旦Fas与FasL 结合，它们将启动凋亡信号的传导，进一步加剧心肌细胞凋亡。此外，细胞凋亡还能影响心肌细胞的修复和再生，从而影响心脏的结构和功能。据报道，正常心肌组织Fas、FasL蛋白表达较低，AMI 发生后其表达明显上升，抑制Fas、FasL 蛋白表达，可减少Caspase-8、Caspase-3活化［17］。另有研究报道，下调Fas、FasL 表达可减轻炎症反应，抑制心肌细胞凋亡，改善左心室重塑［18］。本研究结果显示，Fas、FasL 在模型组心肌组织中高表达，舒芬太尼可显著下调Fas、FasL 表达，抑制心肌细胞凋亡。Fas 慢病毒转染可逆转舒芬太尼对AMI大鼠心肌细胞凋亡的保护作用。提示舒芬太尼可能通过下调Fas、FasL 表达而抑制AMI 大鼠心肌细胞凋亡。

综上所述，舒芬太尼可改善AMI 大鼠心功能，抑制心肌细胞凋亡，并且1 µg/kg 舒芬太尼的作用效果要优于0.1 µg/kg 舒芬太尼；抑制Fas/FasL 信号通路激活可能是舒芬太尼改善AMI 大鼠心功能的作用机制之一。但舒芬太尼调控Fas/FasL 信号通路的具体分子机制仍不十分清楚，尚需进一步研究。