口腔扁平苔藓患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平与病损程度及Th17/Treg失衡的关系

李玲玲，梁伟腾，后珉红

天津市第四中心医院口腔科，天津300140

口腔扁平苔藓（OLP）是口腔黏膜常见的一种慢性炎症性疾病，全球患病率约为1.01%，好发于30～60岁女性［1］。OLP大多数为良性病变，但仍有0.8%～1.5%患者可恶变为口腔癌，从而严重影响患者生活质量甚至威胁生命安全［2］。目前，OLP 的发病机制尚不完全清楚。普遍认为，CD4＋T 细胞介导的免疫炎症反应可参与OLP的发生、发展，而辅助性T细胞17（Th17）/调节性T 细胞（Treg）失衡在免疫炎症反应中发挥重要作用［3］。微小核糖核酸（miRNA）是一类内源性非编码单链小RNA 分子，能够在翻译水平上调控基因的表达。miR-155-5p 是一种高度保守的miRNA，具有调控T 淋巴细胞增殖、分化及功能的作用［4］。有研究报道，在OLP 组织中miR-155-5p高表达［5］。细胞因子信号传导抑制蛋白1（SOCS1）是细胞因子信号传导过程中的负性调节因子，亦可参与调控T 淋巴细胞增殖、分化等。HU 等［6］研究发现，在OLP 组织中SOCS1 低表达。但OLP 患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平与病损程度及Th17/Treg失衡的关系仍不清楚。鉴于此，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2021 年1 月—2023 年7 月天津市第四中心医院口腔科收治的OLP 患者76例（观察组）。OLP 诊断依据《口腔扁平苔藓诊疗指南（修订版）》［2］，其中非糜烂型 28例、糜烂型 48例（轻中度糜烂29例、重度糜烂19例）。纳入标准：①符合OLP诊断标准；②初诊；③年龄≥18 岁；④病历资料完整。排除标准：①伴其他口腔疾病者；②伴类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病等其他免疫炎症性疾病者；③合并急慢性感染或恶性肿瘤者；④合并心、肝、肾等重要脏器严重功能障碍者；⑤近3个月内使用免疫抑制剂、糖皮质激素或抗生素者；⑥妊娠期或哺乳期妇女。其中，男17例、女59例，年龄22～58（48.19 ±6.20）岁。同期随机另选在天津市第四中心医院体检健康的志愿者50例（对照组），男11例、女39例，年龄18～55（48.02 ± 6.07）岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经天津市第四中心医院伦理委员会批准（批件编号：IRM-DWLL-2019139），所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 表达检测 观察组入组次日、对照组体检当日，采集空腹外周静脉血4 mL，待血液自然凝固后，取上清液，3 000 r/min离心10 min、离心半径8 cm，留取上层血清。采用TRIzol 法提取血清总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按PrimeScript RT Master Mix 说明将总RNA 逆转录合成为cDNA。以cDNA 为模板，按SYBR®Premix EX Taq™ Ⅱ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：miR-155-5p 上游引物5'-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3'、下游引物 5'-TTGGGTACCTTAAGTCAAGAG-3'，内参U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；SOCS1 上游引物5'-GCCCTTAGCGTGAAGATGG-3'、下游引物5'-TGTGCGGAAGTGGTGTGTGT-3'，内参GAPDH 上游引物5'-CTTTGGTATCGTGGAAAGACTC-3'、下游引物5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3'。PCR反应体系共25 µL：2 × SYBR Green Master PCR Mix 12.5 µL，cDNA模板5 µL，上下游引物各1.5 µL，ddH2O 补足至25 µL；反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、64 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s共40 个循环。PCR 扩增反应结束，绘制熔解曲线，收集循环阈值（CT）数。以U6 或GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 外周血Th17、Treg 比例检测 观察组入组次日、对照组体检当日，采集空腹外周静脉血3 mL，枸橼酸钠抗凝并等体积稀释后，加入异硫氰酸荧光素标记的小鼠抗人CD4抗体培养30 min。然后分别加入代表Th17 的抗IL-17A 抗体和代表Treg 的抗叉头盒蛋白P3 抗体，避光孵育20 min。采用MACSQuant流式细胞仪检测Th17、Treg 细胞占CD4 细胞比例（即Th17、Treg 比例），计算Th17/Treg。实验重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用独立样本t检验。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis 检验，进一步两两比较采用Mann-WhitneyU检验，两组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。相关性分析采用Pearson 或Spearman 相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比较 见表1。

表1 两组血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比较

2.2 不同类型OLP患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比较 见表2。

表2 不同类型OLP患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比较

2.3 OLP 患者血清miR-155-5p 水平与SOCS1 mRNA 水平的关系 Pearson 相关分析显示，OLP 患者血清miR-155-5p 水平与血清SOCS1 mRNA 水平呈负相关关系（r＝-0.809，P＜0.01）。

2.4 OLP 患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平与外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg 的关系 OLP患者血清miR-155-5p 水平与外周血Th17 比例、Th17/Treg 均呈正相关关系（r/rs分别为0.819、0.820，P均＜0.05），与Treg 比例呈负相关关系（r=-0.735，P＜0.05）；血清SOCS1 mRNA 水平与外周血Th17 比例、Th17/Treg 均呈负相关关系（r/rs分别为-0.770、-0.790，P均＜0.05），与Treg 比例呈正相关关系（r=0.733，P＜0.05）。

3 讨论

OLP 是发生于口腔黏膜的自身免疫性、非感染性、慢性炎症性疾病，其发病与口腔局部刺激、感染、免疫等因素有关［2］。OLP 不仅会损害口腔黏膜，口腔局部炎症反应还能通过血液循环引起全身炎症反应，导致心血管疾病、神经系统疾病、消化系统疾病等，同时因口腔黏膜损伤迁延难愈还会增加口腔癌的发生风险［7］。目前，对于OLP 临床尚无根治办法或特效治疗药物。因此，深入探索OLP 的发生机制对提高其诊治水平具有重要意义。

有研究表明，CD4＋T 细胞功能异常能够引起细胞免疫功能紊乱，通过攻击口腔黏膜细胞导致口腔黏膜慢性炎症反应，从而促进OLP 的发生、发展［3］。Th 细胞是CD4＋T 细胞被激活分化而来，能够分泌多种细胞因子，在维持机体正常免疫功能方面发挥重要作用。其中，Th17可通过分泌IL-17A～IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26、TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等促炎细胞因子，促进炎症反应；Treg通过分泌IL-10、IL-35、叉头盒蛋白P3、转化生长因子β 等抗炎细胞因子，抑制炎症反应，具有很强的免疫抑制活性。正常免疫状态下，Th17/Treg 处于动态平衡，Th17/Treg 失衡则会引起CD4＋T 细胞功能异常，从而导致OLP的发生、发展［8-9］。本研究结果显示，OLP患者外周血Th17 比例和Th17/Treg 明显升高，二者随着病损程度增加而逐渐升高；而外周血Treg 比例明显降低，并且随着病损程度增加而逐渐降低。结果表明，OLP 患者外周血Th17/Treg 明显失衡，并且Th17/Treg失衡与OLP病损程度增加有关，与既往研究［8-9］报道一致。

miRNA 是一类内源性非编码单链小RNA 分子，可通过与靶mRNA 的3′非翻译区特异性结合而抑制mRNA 翻译或促进其降解［10］。miR-155-5p 属于miRNA 家族成员之一，定位于人染色体21q21.3。既往研究发现，miR-155-5p 在激活的免疫细胞中高表达，如巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞等，而敲除miR-155-5p 则会导致免疫细胞功能破坏，提示miR-155-5p 对维持机体免疫功能十分重要［11］。ZHENG 等［12］研究报道，上调miR-155-5p表达能够促进CD4＋T 细胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，导致慢性牙周炎患者外周血Th17/Treg 失衡。ZHU等［13］研究发现，沉默miR-155-5p 表达能够抑制CD4＋T 细胞向Th17 分化，并促进其向Treg 分化，进而减轻炎症性肠病患者外周血Th17/Treg 失衡。本研究结果发现，观察组血清miR-155-5p 水平明显高于对照组，与其在OLP 组织中的表达变化一致［5］。本研究结果还发现，非糜烂型OLP 及糜烂型OLP 轻中度糜烂、重度糜烂患者血清miR-155-5p 水平逐渐升高，提示血清miR-155-5p 水平升高与OLP 病损程度增加有关。进一步研究发现，OLP 患者血清miR-155-5p水平与外周血Th17 比例和Th17/Treg 呈正相关关系，与Treg 比例呈负相关关系，提示血清miR-155-5p 水平升高可能通过诱导外周血Th17/Treg 失衡参与OLP 的发生、发展。究其原因，血清miR-155-5p 水平升高能够诱导初始CD4＋T 细胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，从而导致外周血Th17/Treg失衡。

SOCS 家族是一类能够反馈性阻断细胞因子信号传导的负性调节因子，包括SOCS1～SOCS7及CIS等成员。SOCS1 在T 细胞分化、发育的各个阶段均有表达，SOCS1 缺失可导致T 细胞分化和发育异常［14］。既往研究报道，SOCS1 能够抑制CD4＋T 细胞向Th17分化并促进其向Treg分化，而SOCS1缺陷或缺失则会导致Th17/Treg 失衡［15］。因此，SOCS1 对CD4＋T 细胞分化发育具有重要的调控作用。本研究结果发现，观察组血清SOCS1 mRNA 水平明显低于对照组，与其在OLP 组织中表达变化一致［6］。本研究结果还发现，非糜烂型OLP 及糜烂型OLP 轻中度糜烂、重度糜烂患者血清SOCS1 mRNA 水平逐渐降低，提示血清SOCS1 mRNA 水平降低与OLP 病损程度增加有关。进一步研究发现，OLP 患者血清SOCS1 mRNA 水平与外周血Th17 比例和Th17/Treg呈负相关关系，与Treg 比例呈正相关关系，提示血清SOCS1 mRNA 水平降低可能通过诱导外周血Th17/Treg 失衡而参与OLP 的发生、发展。究其原因，血清SOCS1 mRNA 水平降低能够诱导初始CD4＋T 细胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，从而导致外周血Th17/Treg失衡。本研究还发现，OLP患者血清miR-155-5p 水平与血清SOCS1 mRNA 水平呈负相关关系，提示miR-155-5p 和SOCS1 可能通过调节外周血Th17/Treg 平衡而参与OLP 的发生、发展。近年研究表明，miR-155-5p 与SOCS1 具有靶向调控关系，如在系统性硬化症、风湿性关节炎中，miR-155-5p高表达能够靶向下调SOCS1表达而导致Th17/Treg 失衡［16-17］。最近CHENG 等［18］研究亦指出，miR-155-5p 能够通过靶向抑制SOCS1 表达而诱导口腔黏膜上皮细胞分泌炎症因子，进而促进OLP的发生、发展。但二者在OLP 发生、发展中的具体作用机制及靶向调控关系仍需进一步研究。

综上所述，OLP患者血清miR-155-5p水平升高、血清SOCS1 mRNA 水平降低，二者水平变化与病损程度加重和Th17/Treg失衡密切相关。