基于妇科肿瘤耐药治疗中工程化外泌体的应用研究进展

郭鑫，张建楠，郭楠，宁文婷，尚海霞

妇科恶性肿瘤的晚期治疗是以放化疗为主的综合治疗，铂类及紫杉醇类药物作为妇科恶性肿瘤化疗药物的代表药物，极易出现耐药。国内外研究者发现的化疗耐药机制有：①多重耐药基因的表达，如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）；②遗传因素，如表观遗传、关键酶抑制、基因突变等；③生长因子异常高表达；④DNA 损伤修复能力增强；⑤凋亡抑制途径；⑥上皮－间质转化。因此，如何解决化疗药物的耐药性已经成为目前妇科恶性肿瘤治疗的研究重点。外泌体（exosome）是一种细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，其携带的蛋白质、mRNA 和微小RNA（microRNA，miRNA）在机体的多种生理、病理过程及肿瘤演进中都发挥着重要作用。外泌体不仅可以作为肿瘤诊断和治疗监测的生物标志物，还因为其具有低免疫原性、高稳定性、先天和获得性靶向性的优势，可以作为一种天然的靶向治疗载体，携带抗肿瘤药物或生物大分子，降低化疗药物的耐药性，提高化疗药物的治疗效果。因此，本文就外泌体作为妇科肿瘤化疗耐药治疗药物载体的研究进展进行综述。

1 外泌体作为靶向治疗药物载体的优势

1.1 来源外泌体是直径约40～100 nm、具有磷脂双层膜结构的囊泡，经囊泡外膜与细胞膜融合后释放到细胞外基质中，发挥信息传导和物质运输的作用。研究认为几乎所有类型的正常细胞都能产生外泌体，但并非所有细胞衍生的外泌体都适合作为药物载体[1]。目前使用最多的是来源于间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）和牛奶的外泌体[2-3]。

来源于间充质干细胞的外泌体（mesenchymal stem cell exosome，MSC-Exo）具有与MSC 相同的特质，如促进损伤修复、调节免疫反应、促进伤口愈合和药物递送等[4]。MSC-Exo 作为药物载体，能提高化疗药物抑制肿瘤的效果，降低药物本身的毒副反应，减轻对其他器官的生物毒性。经过修饰的MSC-Exo 具有更强的肿瘤靶向能力、更高的药物递送精准度，在肿瘤治疗中更为安全、有效[5-6]。

来源于牛奶的外泌体（milk exosome）具有稳定性、可耐受性、可塑性、携带药物的多样性和肿瘤靶向性，无不良的免疫和炎症反应。另外，这种外泌体作为化疗药物载体，还可使药物免受胃酸和降解酶的影响，提高其生物利用度[7]，降低给药总剂量，最大限度地减少因大剂量给药而产生的毒性[8-9]。因此，来源于牛奶的外泌体在治疗疾病方面具有巨大的潜力，但其长期的安全性仍有待观察[5]。

1.2 优势目前，外泌体作为纳米药物载体在药物输送方面的优势有：①生物相容性好，与合成脂质体相比，不会引起急性免疫反应；②免疫原性低，外泌体特殊的表面分子能够避免与抗体、凝血因子等产生相互作用；③靶向性及穿透性高，外泌体不仅能促进特定细胞的识别和相互作用，而且能穿透某些生物屏障（如血脑屏障）到达治疗靶点[10]；④药物传递效率高，与传统的脂质体相比，外泌体与核酸分子的亲和性更好，能显著提高包封效率[11-13]；⑤外泌体作为载体可以提高药物释放效率、增加药物血液循环时间[14]。因此，外泌体可作为化疗药物的一种有前景的药物递送载体。

1.3 外泌体的载药方式外泌体作为一种新型的纳米级载药系统，其关键步骤就是开发一种有效的药物装载方法，提高其装载效率。目前使用的药物装载方法包括药物共孵育法、物理制备法、皂化及外泌体的表面修饰法。采用这些方法可在外泌体表面或者内腔修饰和装载所需药物从而实现递送[11-12，15-16]。如药物共孵育法是将外泌体和药物在适当条件下直接混合，使得一部分药物可以分配到外泌体中，加载效率主要取决于溶液中药物的浓度梯度及其疏水性，其优点是操作简单，反应条件温和，但孵育加载药物效率较低[17]。物理制备法包括电穿孔法、超声法和冻融法[10]等，其优点是通过破坏外泌体膜的完整性使药物更易进入外泌体，生物安全性较高，但破膜可能影响外泌体的特性[18]。由于皂素本身有一定的毒性，外泌体的表面修饰法对设备的要求较高，所以皂化及外泌体的表面修饰法目前使用相对较少。总之，临床应用时，首先需要选择合适的外泌体来源细胞，其次，药物的理化特性决定了其装载方式及装载效率。因此，最佳的装载方法应该是经验性地测试每种药物以获得最高的装载效率。

2 外泌体靶向治疗妇科恶性肿瘤的应用

2.1 卵巢癌铂类+紫杉醇是晚期卵巢癌患者初始治疗最常用的一线治疗药物。但大多数患者经初始治疗后迅速耐药，这无疑增加了治疗的难度。而外泌体自身的特征使其可作为载体将药物靶向递送进入肿瘤细胞，降低化疗药物的耐药性，提高治疗效果[19]。

2.1.1 MSC-Exo Melzer 等[20]将紫杉醇孵化载入从人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stemcell，hUCMSC）MSC544 提取出的外泌体（MSC544-derived exosomes paclitaxel，MSC544-Exo-PAC）中，将其与卵巢癌SKOV3 共培养，结果发现相对于游离紫杉醇，MSC544-Exo-PAC 使SKOV3 卵巢癌细胞的活力下降了（75.1±1.0）%，证明相对于游离紫杉醇，MSC544-Exo-PAC 药物传递的效率增高，对肿瘤的治疗效果更好，机制可能是由于其具有较高的肿瘤靶向性。Qiu 等[21]将20 μg/mL hUCMSC 中分离出的外泌体与卵巢癌SKOV3、耐多西紫杉醇（docetaxel，DTX）细胞SKOV3/DTX、A2780、耐紫杉烷（taxane，TAX）细胞A2780/TAX 这4 种细胞分别共培养24 h（装载外泌体），再分别采用5 μmol/L DTX、2 μmol/L TAX 再培养2 h，结果发现与磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）空白对照组（未装载外泌体）相比，与外泌体共培养后的卵巢癌SKOV3、SKOV3/DTX 和A2780、A2780/TAX 对DTX 和TAX 的作用更敏感，肿瘤细胞的存活率更低，凋亡细胞比例升高（P＜0.05），证明hUCMSC 来源的外泌体可以降低卵巢癌细胞系对化疗药物的耐药性，其机制可能是hUCMSC 释放的外泌体miR-146a 通过磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路实现的。

2.1.2 来源于牛奶的外泌体 Aqil 等[22]先后进行了细胞实验和动物实验，他们先将花青素（anthocyanidin）通过超速离心法加载到提取自牛奶的外泌体（exosomal anthocyanidin，Exo-Anthos）中，再与卵巢癌细胞A2780、OVCA433 共培养24 h，然后进行细胞增殖实验，结果发现在达到相同的生长抑制效果时，Exo-Anthos 使用的药物浓度与游离花青素相比明显降低，Exo-Anthos 和花青素的药物半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）相差20倍；随后的动物实验也证明了这一结果，考虑可能是Exo-Anthos 通过抑制过度表达的多重耐药基因Pgp，降低了花青素的耐药，有效地抑制了肿瘤细胞的增殖。

2.1.3 其他来源的外泌体 Zhang 等[23]将顺铂（cisplatin，DDP）通过药物共孵育方法加载到人脐带血来源的M1 型巨噬细胞外泌体（umbilical cord-derived M1 macrophage exosome cisplatin，M1-Exo-DDP）中，其装载效率为30%，将之与卵巢癌A2780 和A2780/DDP（耐DDP 卵巢癌细胞系）细胞共培养72 h 后，进行细胞增殖实验及凋亡实验，结果发现在A2780 和A2780/DDP 细胞中，负载低浓度DDP 的M1-Exo-DDP在体外的凋亡率高于单独使用相同浓度的DDP。究其原因，可能是由于M1-Exo-DDP 可以通过增加药物进入肿瘤细胞内的数量，减少渗出，降低DNA 修复能力，提高卵巢癌细胞对DDP 的敏感性，因此认为在低浓度下M1-Exo-DDP 比游离DDP 具有更强的抑制肿瘤细胞增殖的能力。Luo 等[24]将DDP 通过电穿孔装载在来源于自然杀伤（natural killer，NK）细胞的外泌体（exosomes derived from expanded natural killer cell，eNK-Exo-DDP）中，将等量的eNK-Exo、DDP和eNK-Exo-DDP 与SKOV3 细胞共培养24 h，通过增殖实验和凋亡实验证明eNK-Exo-DDP 抑制卵巢癌细胞生长的效率显著高于游离DDP。

2.2 宫颈癌晚期宫颈癌的主要治疗手段有化疗、放疗等，但由于化疗药物耐药性的存在，局部控制率低，治疗效果欠佳，易发生远处转移。因此，目前宫颈癌基础研究和临床研究的热点在于寻找新的治疗靶点和提高化疗药物的靶向性。已有研究发现以外泌体作为载体，将化疗药物靶向送入宫颈癌细胞中，可以降低化疗药物的耐药性，提高其治疗效果。

2.2.1 MSC-Exo Abas 等[25]将紫杉醇通过电穿孔法载入提取自UCMSC 的外泌体中，装载效率为62%。装载紫杉醇的外泌体（paclitaxel exosome，Exo-PAC）与宫颈癌HeLa 细胞共孵育24 h 后进行细胞增殖和凋亡实验，细胞增殖实验发现游离紫杉醇的IC50为（18.62±2.33）μg/mL，Exo-PAC 的IC50为（13.21±1.82）μg/mL；Annexin-V 凋亡实验提示外泌体组（Exo 组）细胞凋亡率为（0.81±0.05）%，Exo-PAC 组细胞凋亡率为（33.71±1.55）%，2 组差异有统计学意义（P＜0.001）。提示相对于游离紫杉醇，Exo-PAC 使肿瘤细胞的增殖活力降低，对肿瘤的抑制作用更强，证实其机制可能是由于Exo-PAC 可抑制肿瘤的上皮-间质转化，从而降低肿瘤细胞对紫杉醇的耐药性。

2.2.2 来源于牛奶的外泌体 姜黄素（curcumin）是一种存在于姜黄根茎中的天然多元酚，具有抗炎症、抗恶性肿瘤细胞增殖、抗血管生成等作用。但姜黄素因水溶性差、体内代谢快和易被清除等特点限制了其临床应用。Aqil 等[26]将姜黄素通过超速离心法装载于提取自牛奶的外泌体（exosomal curcumin，Exo-Cur）中，装载效率为53.9%，结果发现当游离姜黄素和Exo-Cur 浓度分别为1.56 μmol/L 时，Exo-Cur 对宫颈癌HeLa 细胞的生长抑制作用更强，Exo-Cur 组肿瘤细胞存活率仅为20%～30%，而姜黄素组肿瘤细胞存活率为65%～90%。将宫颈癌CaSki 细胞皮下注射到裸鼠中进行动物实验，随机分组后分别予外泌体、姜黄素、Exo-Cur 口服，发现与游离的姜黄素相比，Exo-Cur 对肿瘤细胞生长的抑制作用显著增高（61%vs.21%）。Exo-Cur 表现出更强的抗增殖和抗肿瘤活性。

2.2.3 其他来源的外泌体 Abbasifarid 等[27]用超声法将藏红花素（crocin）和姜黄素加载在来源于人胚胎肾细胞HEK-293T 的外泌体（exosomal crocin，Exo-Cro；Exo-Cur）中，同时将自行构建的人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）L1-E7 多肽分别与Exo-Cro、Exo-Cur 和HEK-293T 细胞共培养，发现L1-E7多肽和空外泌体对非癌性HEK-293T 细胞无细胞毒作用（存活率为95%～98%）。藏红花素、姜黄素、Exo-Cro 和Exo-Cur 共培养的细胞存活率分别为78%～81%、76%～79%、90%～92%和91%～94%。结果表明L1-E7 多肽组、空外泌体组、Exo-Cro 组、Exo-Cur 组、藏红花素组、姜黄素组对非癌性HEK-293T 细胞的毒性作用均较低。而在小鼠动物模型中发现，接种肿瘤细胞后65 d，PBS 组（空白对照组）肿瘤生长率约为80%，空外泌体组肿瘤生长率约为45%，而L1-E7多肽+Exo-Cro 组和L1-E7 多肽+Exo-Cur 组小鼠均未见肿瘤生长（P＜0.001），相对于PBS 组（0%）、空外泌体组（0%），L1-E7 多肽+Exo-Cro 组和L1-E7 多肽+Exo-Cur 组小鼠存活率均为100%，L1-E7 多肽组、Exo-Cro 组和Exo-Cur 组小鼠存活率均为80%，肿瘤生长明显受到抑制。其机制可能在于外泌体装载的藏红花素或姜黄素和L1-E7 多肽可以显著诱导T 细胞免疫应答，达到消灭肿瘤细胞的效果。HPV L1-E7 多肽在其中可能起到了促进作用。值得一提的是，该项研究将正常细胞纳入研究，并证明了外泌体及外泌体装载药物对非癌性细胞无毒性作用，这也为临床应用外泌体作为药物载体的安全性提供了依据。

2.3 子宫内膜癌目前晚期子宫内膜癌的治疗手段主要为放化疗为主的综合治疗。外泌体在子宫内膜癌中的研究仍然集中在机制研究阶段，仍未发现装载化疗药物的相关研究[28-29]。Li 等[30]从人体正常细胞的成纤维细胞（normal fibroblast，NF）及子宫内膜癌中的成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）分离出外泌体，将NF 衍生的外泌体和CAF 衍生的外泌体与子宫内膜癌细胞系进行共培养，发现与来自NF 的外泌体相比，CAF 来源的外泌体显著促进子宫内膜癌细胞的侵袭。另外，将CAF 来源的外泌体中的miR-148b 转移到子宫内膜癌细胞后，miR-148b 可以直接与下游靶基因DNA 甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）结合，抑制上皮－间质转化，从而发挥抑癌作用。因此认为将来源于细胞外基质的miR-148b 转染子宫内膜癌细胞可能是阻断疾病进展的一种潜在的治疗方法。Zhou 等[31]提出CD45RO-CD8+T 细胞来源的外泌体富含miR-765，可通过雌激素受体β（estrogen receptor β，ERβ）/miR-765/蛋白脂蛋白2（proteolipid protein 2，PLP2）/Notch 轴限制雌激素依赖的子宫内膜癌的发展。Qian等[32]从子宫内膜癌患者的血清中提取出外泌体tRF-20-S998LO9D，经过实验验证发现tRF-20-S998LO9D 可以抑制子宫内膜癌细胞迁移、增殖和侵袭，促进细胞凋亡，提示tRF-20-S998LO9D 是子宫内膜癌抑制因子，因此认为外泌体tRF-20-S998LO9D 有可能成为子宫内膜癌的生物标志物。到目前为止，外泌体作为药物载体靶向治疗子宫内膜癌的研究仍未见报道，期待更多、更深入的药物相关的研究。

3 结语

在妇科三大肿瘤中，外泌体作为新兴的纳米级药物递送载体，不仅为化疗药物的输送提供了新的方法，而且降低了肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。目前的研究中外泌体的来源主要集中在MSC 和牛奶，但也有巨噬细胞、NK 细胞及正常细胞，药物大多选择铂类和紫杉醇类，其装载方式以药物共孵育法为主，装载效率高低不一，但相对于游离的化疗药物，装载入外泌体后的化疗药物对于肿瘤细胞增殖的抑制效果得到了显著的提高。综上所述，以外泌体作为药物载体的妇科肿瘤靶向治疗仍停留在基础研究和临床前研究阶段，尚无临床试验来证明其临床应用的可行性。在生物安全性方面，目前仅有Abbasifarid等[27]进行了初步的实验验证。外泌体的临床转化仍有一些问题亟待解决：首先，如何在保证外泌体功能的基础上提高药物的装载效率是目前需要解决的首要问题；其次，母细胞来源的外泌体虽然装载量不可控，但其具有母细胞本身的生物特性，更有利于药物递送，如何提高这种母细胞来源外泌体装载效率也值得关注；最后，临床应用需要有能够保证外泌体结构完整性、高浓度、高纯度以及量产的实验技术。相信在多学科的共同努力下，工程化外泌体的临床转化一定会得到不断的改进，一定能为临床妇科肿瘤化疗耐药问题的解决提供新手段。