荧光图像引导手术在妇科恶性肿瘤的研究进展

贾炎峰，党云

妇科恶性肿瘤手术R0 切除（完整切除肿瘤，切缘无癌细胞）是影响患者生存的重要因素之一[1]。然而，由于妇科肿瘤常波及多个器官及组织，手术前常用的影像学检查对微小转移病灶敏感度较低，并且即使术中依靠手术医生视触觉及经验评估，也可能遗漏亚毫米的腹膜转移病灶，手术切除不完全是其短期复发的主要原因。荧光图像引导手术（fluorescence image-guided surgery，FIGS）采用近红外荧光（near-infeared fluorecence，NIR）显像剂与专门的光学成像系统结合，可以通过荧光显示手术区域目标组织或器官，作为实时、非侵入性和高分辨率的诊断方式，为外科医生提供屏幕图像，实现术中实时导航、精准切除病灶的效果。近年来，FIGS 已成为外科领域发展最快的创新技术之一，现就FIGS 在妇科恶性肿瘤中的应用进展进行综述。

1 FIGS 简介

FIGS 是在术中使用NIR 显像剂，经过成像系统提高肿瘤组织与正常组织的对比度，以增强肿瘤组织显影，实现手术医生以实时可视化的方式、在不损伤正常组织器官的前提下尽量完整地切除病变组织。FIGS 在妇科恶性肿瘤的应用主要包括组织结构和功能成像及靶向分子成像两方面。NIR 分为一区（NIR-Ⅰ，700～900 nm）和二区（NIR-Ⅱ，1 000～1 700 nm），相较于可见光光谱（400～700 nm），生物组织对该波长范围的光吸收较低、自发荧光少，尤其是NIR-Ⅱ的荧光波长更长，具有更深的组织穿透力、更低的背景信号。目前，手术中使用的荧光成像系统已拓展到NIR-Ⅰ荧光，并整合到腹腔镜及机器人手术系统中。NIR 染料可分为有机类和无机类，有机类染料包括菁染料类、氟硼二吡咯化合物（BODIPY）类、罗丹明类、方酸类和卟啉类，如花菁染料吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）、甲川花菁染料Cy 系列、噻嗪类染料亚甲基蓝、经过修饰的ICG（如ZW-800、IRDye800）和经过修饰的罗丹明类染料Alexa Fluo；无机类染料主要包括单壁纳米碳管、半导体量子点和稀土纳米材料等。

由于NIR 染料自身没有肿瘤特异性，研究大多将可与肿瘤细胞特异性受体结合的靶向分子共轭耦联在荧光染料上，将该靶向荧光分子探针用于肿瘤靶向分子成像。靶向分子包括大小不等的抗体、多肽和小分子化合物等。目前针对妇科恶性肿瘤的主要靶向配体是各类具有肿瘤特异性和敏感性的生物标志物，如糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、叶酸受体α（folate receptor α，FRα）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和整合素ανβ3 等。

2 组织结构和功能荧光成像

外周静脉注射ICG 后，由于ICG 的高通透性长滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR），其可迅速与血浆蛋白结合，进入有新生血管的组织，从而实现病变组织结构荧光成像的效果。另外，ICG 在皮下注射后可与脂蛋白结合进入淋巴循环，通过淋巴引流成像淋巴脉管和淋巴结，手术医生可以进行淋巴绘图和前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN）检测。

2.1 SLN 检测SLN 是肿瘤细胞经淋巴管引流的第一站淋巴结，是最早发生肿瘤转移的淋巴结。FIGS最常用于妇科恶性肿瘤SLN 检测，手术中切除检测阳性的SLN，若检测阴性则行系统淋巴结清扫术。SLN检测技术在妇科肿瘤中最早应用于外阴癌。Matsuo等[2]研究发现，ICG 在美国外阴癌手术SLN 检测中的使用从2006 年的16.8%增加到2020 年的45.2%。Nahshon 等[3]利用SEER 数据库识别41 411 例子宫内膜癌患者，按1∶1 配对SLN 检测组和淋巴结清扫组各6 019 例，随访16 个月发现SLN 检测组1 年生存率高于淋巴结清扫组（HR=1.61，95%CI：1.17～2.21，P=0.004）。一项前瞻性多中心研究纳入31 例早期卵巢癌患者，将ICG 注入骨盆漏斗韧带周围的组织中，21 例检出SLN，检出率为67.7%，初步证明了SLN 在早期卵巢癌检测中的可行性[4]。Agusti 等[5]的Meta 分析纳入9 项研究共113 例早期卵巢癌患者，结果显示SLN 检出率为93.3%（95%CI：77.8%～100%），阴性预测值为100%（95%CI：97.6%～100%），99mTc 联合ICG 注射到子宫-卵巢韧带和骨盆漏斗韧带时检测率最佳（100%，95%CI：94%～100%），认为SLN 对早期卵巢癌具有较高的检出率和阴性预测值，但该研究证据质量有限，在常规临床实施之前需进一步研究验证。下肢淋巴水肿和淋巴囊肿是妇科恶性肿瘤的常见并发症之一，Terada 等[6]研究纳入388 例子宫内膜癌患者，201 例患者接受SLN 检测，187 例患者接受盆腔淋巴结清扫，SLN 组下肢淋巴水肿（2.0% vs.21.3%）和淋巴囊肿（0 vs.2.1%）的发生率低于淋巴结清扫组。Berasaluce Gómez 等[7]利用SUCCOR 队列纳入201 例接受SLN 检测联合淋巴结切除术和187 例仅行淋巴结切除术的宫颈癌患者，术后辅助治疗比例分别为33.8%和44.7%（P=0.02），与仅行淋巴结切除术的患者相比，接受SLN 检测联合淋巴结切除术的患者死亡风险更高（HR=3.49，95%CI：1.04～11.7，P=0.042）。虽然SLN 检测避免了不必要的大范围淋巴结清扫术，减少了相关并发症，但是SLN 检测联合淋巴结切除术得到阴性结果时，可能会使患者术后缺乏必要的辅助治疗，进而会对疾病复发和患者生存产生不利影响。美国国家综合癌症网络（NCCN）指南也将SLN 用于早期宫颈癌、子宫内膜癌检测推荐为2A 类证据，但其临床应用仍存有争议，如示踪剂的敏感度、注射剂量和部位等。SLN 检测也可能会对患者预后及辅助治疗产生影响，病理超分期的应用可能会增加微转移的检出率，但这还需更多的临床试验验证。

2.2 结构和功能成像宫颈癌根治术中离断阴道是肿瘤细胞腹膜扩散的危险因素。Ramirez 等[8]认为与开腹子宫切除术相比，腹腔镜手术可能导致肿瘤细胞扩散，增加腹膜污染率，从而增加宫颈癌复发率。Klapdor 等[9]在行腹腔镜下子宫切除术之前通过宫颈注射ICG 以评估术中宫颈分泌物在腹腔内的污染率，结果发现75%的宫颈癌患者存在腹膜污染，60%的患者发生器械污染。由此可见，荧光信号可实现宫颈分泌物腹膜污染的可视化，基于ICG 的荧光成像技术可进一步用于评估腹膜污染对患者生存预后的影响，并可作为外科医生和手术技术的质量评估工具。Nguyen-Xuan 等[10]使用FIGS 实时检测术中肿瘤边缘，报道1 例第1 次手术未完整切除的外阴癌患者再次通过FIGS 切除外阴，术后病理证实切缘阴性。早期宫颈癌保留生育功能手术中，是否保留子宫动脉一直存有争议。Escobar 等[11]在广泛性宫颈切除术中使用ICG 进行血管造影评估子宫灌注，保留子宫动脉组（10 例）和未保留子宫动脉组（10 例）子宫底ICG 荧光强度相近，所有患者术后8 周均恢复月经；中位随访22 个月，保留子宫动脉组妊娠4 例（40%），未保留子宫动脉组妊娠3 例（30%），认为在宫颈癌保留生育功能手术中可以不用保留子宫动脉。宫颈癌患者行广泛性子宫切除术时，切断子宫动脉输尿管支可能导致术后输尿管缺血性坏死和输尿管瘘等并发症。姚瑶等[12]对2 例ⅠB1 期宫颈鳞癌患者行广泛性子宫切除术中使用ICG 识别子宫动脉输尿管支并保留，随访4 个月未出现输尿管缺血相关并发症。提示ICG 荧光血管造影技术有助于医生识别血管、评估血管血流及相关组织灌注情况。Höckel等[13]提出基于胚胎学的隔间或腔室（compartment）理念可用于妇科恶性肿瘤的治疗。Kimmig 等[14]在子宫内膜癌患者进行子宫全系膜切除术（即将苗勒管隔间的所有解剖单元切除）时，通过子宫体注射ICG 发现，荧光可以显像整个苗勒管隔间，从而支持了隔间理念。提示ICG 可辅助用于子宫内膜癌、宫颈癌等妇科恶性肿瘤的治疗。外阴癌术中需切除腹股沟淋巴结，术后易出现腹股沟伤口开裂、难以愈合的并发症，而皮瓣重建是预防腹股沟伤口开裂的重要手段。Gentileschi 等[15]报道1 例61 岁外阴癌患者术后因左侧腹股沟伤口开裂而接受以股外侧皮神经营养血管带蒂皮瓣进行重建，为确认皮瓣血供，术中夹住穿支并行ICG 荧光血管造影，皮瓣显示良好的荧光，术后创面愈合良好。通过影像学诊断转移性肿瘤中的微小病变并进行手术通常具有挑战性，FIGS 可为这类患者提供新的手术策略。Kreklau 等[16]使用ICG 对3例正电子发射计算机体层成像（positron emission tomography and computed tomography，PET/CT）发现的可疑宫颈癌或癌肉瘤转移患者进行腹腔镜检查，均诊断出转移性病灶。FIGS 用于妇科恶性肿瘤结构和功能成像可以显示血管、淋巴结和肿瘤组织等信息，然而ICG 等荧光染料自身没有靶向性，靶向荧光分子探针可特异性靶向于肿瘤组织中的受体，不但能够可视化肿瘤，还可提供病灶分子信息进一步指导治疗。

3 靶向分子荧光成像

非靶向性荧光染料的主要局限性是假阳性率较高，ICG 检测卵巢癌转移病灶的假阳性率达62%[17]。在NIR 成像系统引导下，靶向荧光分子探针可以特异性标记肿瘤，减少假阳性结果。

3.1 靶向荧光分子探针临床试验FRα 在90%以上的上皮性卵巢癌中高表达，是当前研究最多的卵巢癌FIGS 生物标志物之一。2011 年，van Dam 等[18]首次将叶酸耦联异硫氰酸酯荧光素（EC-17）用于卵巢癌靶向分子荧光成像中，12 例患者按0.1 mg/kg 的剂量注射EC-17，术中荧光检测到57 处转移病灶，44 处病灶经病理学证实为FRα 阳性。EC-17 虽然进入了Ⅱ期临床试验（NCT01511055），但由于技术限制该试验终止于2020 年。在另一种叶酸耦联花菁染料帕福拉西宁（OTL38）靶向荧光分子探针的Ⅰ期临床试验中，首先在30 例健康志愿者中进行了4 次OTL38 单次递增剂量注射试验，评估耐受性和药代动力学后筛选出最佳剂量为0.012 5 mg/kg，随后按此剂量对12 例卵巢癌患者注射OTL38，共检出83 处可疑转移病灶，62 处病灶经病理学证实为肿瘤，包括之前常规视野未发现的18 处病灶[19]。Ⅱ期临床试验显示，OTL38 检测卵巢癌病灶的敏感度为85.93%[20]。Ⅲ期临床试验显示，在33%未计划切除且常规视野未发现病灶的FRα 阳性患者中通过OTL38 发现了额外病灶，在接受间歇性肿瘤细胞减灭术的患者中该比例为39.7%，62.4%的患者实现了R0 切除；OTL38检测卵巢癌病灶的敏感度为83.0%，假阳性率为24.8%[21]。子宫内膜浆液性癌和子宫内膜透明细胞癌也有FRα 表达，Boogerd 等[22]临床试验在术前对3 例子宫内膜浆液性癌和1 例子宫内膜透明细胞癌患者静脉注射0.012 5 mg/kg 的OTL38，术中检测到大网膜（n=3）和淋巴结（n=16）的转移灶。OTL38 引导的FIGS 是第一个已完成临床转化并初步取得满意结果的靶向荧光分子探针，已被美国食品药品监督管理局批准用于临床，未来或可成为卵巢癌患者重要的治疗手段。ONM-100 是一种与ICG 共价耦联的pH敏感的新型荧光纳米探针，利用所有实体瘤的通用生物标志物——肿瘤微环境的相对酸性pH，在术中对肿瘤进行成像，ONM-100 在正常的生理pH 值下保持不活动状态，直到暴露于酸性肿瘤微环境触发胶束解离和荧光标记激活。在已完成的Ⅰ期临床试验中，ONM-100 对实体瘤术中成像的敏感度达100%，表明pH 敏感的荧光探针在实体瘤FIGS 中具有较大应用潜力[23]。靶向荧光分子探针在妇科肿瘤临床试验中已取得一定进展，其具有发现靶向病变组织额外转移病灶的高敏感度和特异度，有助于FIGS 在妇科恶性肿瘤中的临床应用。

3.2 靶向荧光分子探针临床前试验多项临床前试验探讨了靶向分子探针在卵巢癌人源性组织异种移植（patient-derived xenografts，PDX）模型中的应用价值。有研究比较了卵巢癌PDX 模型中叶酸结合不同NIR 染料（ZW800-1、ZW800-1Forte、IRDye800CW、ICG-OSU 和合成的Cy7 衍生物）的组织清除特性和肿瘤特异性信号，提示ZW800-1Forte 的特异性荧光信号最强[24]，证实其用于荧光显影时被检测率更好。CD24 在肿瘤细胞中高表达，可作为分子靶向成像治疗的一个新靶点，与NIR 染料共轭的CD24-AlexaFluor680 能够在卵巢癌PDX 模型中识别肿瘤病灶[25]，并可扩展用于透明细胞癌和未分化癌模型中。Fung 等[26]在卵巢癌原位PDX 模型临床前试验中，证实了卵巢癌生物标志物CA125 的靶向抗体B43.13 与IRDye800CW 耦联的靶向分子探针可用于卵巢癌组织的成像。另有研究证明卵巢癌相关抗原COC183B2 在卵巢癌中表达（61.2%～89.9%），据此研发的COC183B2-Cy7 和COC183B2-800 两种荧光探针显示出对卵巢癌具有肿瘤特异性，且COC183B2-Cy7 可以在离体卵巢癌组织中检测到亚毫米级（肿瘤直径小于1 mm）的肿瘤病灶[27-28]。促性腺激素释放激素受体在78%的卵巢癌和其他与激素相关的肿瘤如子宫内膜癌中表达。Liu 等[29]研发的ICG 耦联促性腺激素释放激素拮抗剂靶向荧光分子探针A278047表现出与卵巢癌细胞的高亲和力及高肿瘤背景比，在PDX 模型中可显像肠系膜亚毫米级的肿瘤沉积物（tumor deposit，即瘤周脂肪组织中没有淋巴结结构残留的肿瘤结节）。贝伐珠单抗是一种靶向血管内皮生长因子A 的人源化单克隆抗体，IRDye800CW标记的贝伐珠单抗分子探针用于卵巢癌PDX 模型，可在术中实时成像检测到亚毫米级的肿瘤病变[30]。整合素在腺上皮来源的消化道肿瘤和鳞状上皮来源的肿瘤中过表达，Huisman 等[31]对外阴鳞癌及其癌前病变组织的石蜡切片进行免疫组织化学染色，结果发现整合素ανβ6 阳性的恶性外阴组织肿瘤背景比最高，对外阴鳞癌及其癌前病变与正常组织的区分能力最强，未来可进一步对靶向整合素ανβ6 的荧光分子探针在外阴鳞癌FIGS 中应用进行评估。Shaw等[32]研究表明，基于整合素ανβ3 受体拮抗剂的分子探针可以靶向OVCAR4 卵巢癌细胞。由此可见，整合素能够成为卵巢癌、外阴癌等肿瘤FIGS 的靶向配体。不同靶向配体与不同NIR 染料制成的靶向荧光分子探针在妇科肿瘤FIGS 临床前试验表现出一定的应用潜力，仍需积极开展临床试验验证其安全性和有效性。

4 FIGS 临床应用的局限性

尽管生物标志物-荧光染料共轭的靶向荧光分子探针表现出低毒性、高稳定性和快速清除的优势，但假阳性率高（10%～25%）仍是当前影响其在临床普及应用的主要问题。OTL38 和EC-17 荧光成像的假阳性最常见于淋巴结，这可能与淋巴结中FRβ 过表达的巨噬细胞结合引起假阳性荧光信号有关。但淋巴结的假阳性荧光信号不妨碍OTL38 和EC-17在卵巢癌的应用，因为早期卵巢癌即应进行全面的淋巴结切除分期术，而对于晚期卵巢癌，FIGS 仍有助于检测转移性淋巴结。大网膜和子宫肌瘤上也可出现OTL38 和EC-17 阳性荧光信号，这是由于FRβ不仅是肿瘤组织的生物标志物，也是正常组织中组织驻留巨噬细胞的有用标志物，纤维化和炎症等良性病变也可能出现阳性荧光信号。因此，对于妇科恶性肿瘤FIGS，仍需要特异度更高的荧光分子探针。一系列包含有机小分子、纳米材料的NIR-Ⅱ荧光分子探针正在研发中。Wang 等[33]研发的稀土上转换荧光纳米探针极大地提高了光学成像的信噪比，实现了卵巢癌转移的腹膜以及淋巴结在NIR-Ⅱ荧光成像引导下的精准切除。特定酶激活的荧光探针、正电子发射体层成像（positron emission tomography，PET）/荧光双模态探针等也已进入临床试验阶段。

另外，目前术中荧光信号的评估基于外科医生的主观视觉评价，荧光信号的量化评估也是必要的。正在开发的数字成像分析软件算法可以识别客观荧光阈值，能实现荧光信号的量化评估。尤其是在血流灌注荧光评估领域，使用人工智能开发专用算法，可以分析异质组织中荧光强度随时间的变化，在视频软件荧光分析的帮助下可以动态地揭示肿瘤组织与正常组织的区别。目前，这些系统正在临床前研究中，有待进入临床试验以进一步在临床工作中实践。

5 结语

妇科恶性肿瘤FIGS 作为一种新兴手术策略，能够增加肿瘤组织和正常组织的对比度，增强亚毫米级病灶的可视化，实现肿瘤切缘阴性，从而改善肿瘤分期和风险分层。随着特异度更高的荧光染料的研发以及可以检测和量化荧光信号标准化成像系统的进展，后续可进一步开展与现有腹腔镜成像系统结合、实现可量化的荧光信号及标准化的临床试验。FIGS 实时荧光成像与光热疗法、免疫疗法和抗体-药物结合物的使用，有可能改变现有的治疗方法，改善妇科恶性肿瘤患者的预后。