液质联用法测定婴幼儿奶粉中左旋肉碱含量不确定度评定

◎ 张 伟，杨 敏，李永忠，夏 敏，易佳容

（1.湖南口味王集团有限责任公司，湖南 益阳 413000；2.湖南中益食品化工检测院，湖南 益阳 413000）

左旋肉碱又称L－肉碱，是一种促进人体脂肪转换为动能的类碳水化合物，不仅可用于减肥类的保健食品，也可用于婴幼儿食品。奶粉中的左旋肉碱是促进奶粉中的脂肪分解、代谢、供能的重要营养素，可以促进体内脂肪的代谢和利用。婴幼儿饮食结构比较单一，其主要饮食来源为各种乳制品，主要能量来源为乳制品中的脂肪。添加左旋肉碱，可以提高婴幼儿对奶粉中脂肪的利用率[1]。因此，本文依据SN/T 5146—2019 第二法[2]液相色谱-质谱法测定婴幼儿奶粉中左旋肉碱的含量。同时，分析婴幼儿奶粉中的左旋肉碱含量不确定度，以供参考[3]。

1 材料与方法

1.1 试剂

乙腈（色谱纯，Merck）；甲醇（色谱纯，Merck）；氨水（AR，湖南汇虹）；盐酸（GR，国药集团）；甲酸（HPLC，科密欧），左旋肉碱（坛墨，批号2 362012；含量99.90%；U=0.5%）；D3-左旋肉碱（TRC，批号：5-BKS-60-2）。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准储备液

称取左旋肉碱标准品7.30 mg，乙腈溶解，配制成浓度为729.27 μg·mL-1的标准储备溶液，4 ℃以下避光保存。

1.2.2 标准中间液

准确吸取标准储备液（729.27 μg·mL-1）0.10 mL，用乙腈稀释至10 mL，摇匀，制成7.292 7 μg·mL-1的标准中间液，4 ℃以下避光保存。

1.2.3 D3-左旋肉碱内标标准储备液

准确称取标准品5.00 mg，用乙腈溶解，配制成浓度为500 μg·mL-1的标准储备液，4 ℃以下避光保存。

1.2.4 D3-左旋肉碱内标标准中间液

准确吸取D3-左旋肉碱内标标准储备液（500 μg·mL-1）0.20 mL，用乙腈稀释至10 mL，摇匀，制成10 μg·mL-1的标准中间液，4 ℃以下避光保存。

1.2.5 标准工作液

准确移取标准中间液和内标标准中间液适量，用0.1%甲酸水溶液溶解并稀释，配制成内标浓度为100 ng·mL-1，以及左旋肉碱浓度分别为0.364 6、1.823 2、18.231 2、72.927、145.854、364.635 ng·mL-1的 系列标准溶液，现用现配。

1.3 仪器与设备

AB-3500 液质联用仪（美国AB）；十万分之一电子天平（XS205，梅特勒）；万分之一电子天平（AR224CN，奥豪斯）；ASE-12 固相萃取装置；TG18G-Ⅱ离心机；WD-12 氮吹仪；SHA-C(A）恒温水浴振荡器；SPE 固相萃取柱（Oasis MCX 柱，60 mg/3 mL，Waters）。

1.4 测定方法

1.4.1 样品提取与净化

称取试样1 g →50 mL 离心管→加内标标准中间液100 μL →加入20 mL 的0.1 mol·L-1盐酸溶液→摇匀，超声5 min →加入5 mL 的1 mol·L-1氢氧化钾溶液，混匀→60 ℃水浴皂化30 min →冷却至室温→加5 mL的1 mol·L-1盐酸溶液→涡旋1 min →移至50 mL 容量瓶→用0.1 mol·L-1盐酸溶液润洗离心管，合并润洗液至容量瓶→用0.1 mol·L-1盐酸溶液定容至刻度→取1.00 mL 提取液于15 mL 离心管→加入9.0 mL 乙腈→涡旋混匀1 min →离心→取1.00 mL 上清液过Oasis MCX固相萃取小柱（依次使用3 mL 甲醇、3 mL 水和3 mL 10 mmol·L-1盐酸活化）→用3 mL 的10 mmol·L-1盐酸溶液淋洗→弃去淋洗液→抽干小柱→加2 mL 4%氨水甲醇溶液洗脱→收集洗脱液→40 ℃氮吹干→加入1.0 mL 0.1%甲酸水溶液溶解残渣→过0.22 μm 滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4.2 标准曲线建立

以左旋肉碱和D3-左旋肉碱浓度比为横坐标，左旋肉碱和D3-左旋肉碱内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 建立数学模型

式中，X为样品中左旋肉碱的含量，mg·kg-1；V为样品定容体积，mL；n为样品稀释倍数；m为试样质量，g；1 000 为换算系数。

1.6 不确定度来源的识别

对过程分析可知，左旋肉碱含量测定的不确定度主要有以下4 个方面[4]：样品称量过程引入的标准不确定度urel（m）；样品测试液中左旋肉碱浓度引入的不确定度urel（C）；样品稀释体积引入的不确定度urel（V）；重复性引入的不确定度urel（r）。

2 不确定度分量的评定与合成

2.1 A 类不确定度

重复性引入的不确定度urel（r），主要受操作过程、样品特性和仪器本身性能等因素的影响，独立测定6次，结果如下：35.88、36.27、36.59、35.57、36.59、36.50 mg·kg-1。

6 次测量标准偏差：

实际检测时，进行平行实验，标准不确定度：

重复性引入的相对标准不确定度：

2.2 B 类不确定度

2.2.1 样品称量过程引入的标准不确定度urel（m）

样品平均质量为1.034 4 g，称量范围内的最大允许误差为±0.5 mg，按均匀分布考虑（k=），则称量引入的标准不确定度：

其相对标准不确定度：

2.2.2 样品测试液中左旋肉碱浓度引入的不确定度urel（c）

（1）标准曲线拟合的相对不确定度分量urel（C1）。对6 个标准系列溶液各进样1 次，共计6 次，得到左旋肉碱峰面积A1和D3-左旋肉碱A2，结果见表1。

表1 左旋肉碱标准曲线方程数据表

以左旋肉碱和内标浓度之比为横坐标，左旋肉碱峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线。标准工作曲线为：Y=2.154 16X+0.007 59，相关系数R=0.999 9。

标液中左旋肉碱和内标浓度之比的平均值：

峰面积比值的残差标准偏差：

对被测样品的提取液共测量1 次，即p=1，测得提取液中左旋肉碱浓度和D3-左旋肉碱浓度比值X=0.728 68。于是其标准不确定度u（c1）：

（2）储备液与标准系列溶液的配制引入的不确定度urel（c2）。标准溶液配制时的不确定度主要来源为标准品的称量、标准品纯度和定容。

①标准物质纯度引入的不确定度urel（c21）

本次使用的左旋肉碱标准品的证书标识纯度为99.90%；urel=0.5%，则urel（c21）=0.005；D3-左旋肉碱带入的不确定度不予考虑。

②标准品称量引入的不确定度urel（c22）

本次左旋肉碱标准品配制时采用的是十万分之一电子天平，其质量为7.30 mg，该天平准确度等级为Ⅰ级，在（0 g ≤m≤50 g）称量范围内的最大允许误差为±0.05 mg，可按均匀分布考虑（k=），则标准品称量引入的相对标准不确定度：

③标准溶液配制过程量器具及温度变化引入的不确定度urel（c23）

标准储备液、中间液和标准系列溶液配制中，均用到了移液枪和容量瓶，实验过程中使用的移液枪经校准合格，玻璃量器具均为A 级，根据其最大允差计算；实验室温度在±5 ℃范围内变动，温度对体积的影响可以通过体积膨胀系数进行计算。因溶液的体积膨胀系数大于容量瓶体积的膨胀，故只考虑前者的影响。水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，均假设为三角分布，各量器具带入的相对标准不确定度如下：

合成，得到：

将以上3 个分量进行合成，urel（c2）为：

2.2.3 样品稀释体积引入的不确定度urel（V）

本实验样品处理过程中，用到50 mL 容量瓶（A 级）1 次，1 mL 移液枪移取1.00 mL 溶液3 次，10 mL 刻度移液管（A）移取9.0 mL 溶液1 次，按照JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[5]和JJG 646—2006《移液器检定规程》[6]的要求，按三角分布考虑，则由量器具体积不准引入的相对标准不确定度如下。

50 mL 容量瓶（A 级）体积不准带入的相对标准不确定度：

10 mL 刻度移液管（A 级）量取9.0 mL 体积不准带入的相对标准不确定度：

1 mL 移液枪量取1.00 mL 体积不准带入的相对标准不确定度：

由量器具带入的相对标准不确定度：

2.3 相对标准不确定度的合成与扩展

2.3.1 不确定度的合成

根据以上结果，将urel（m）、urel（c）、urel（V）、urel（r）进行合成，即

2.3.2 不确定度的扩展

扩展不确定度是标准不确定度u（X）乘以包含因子k。取包含因子P95=2，则所测结果扩展不确定度：U=2×1.18 mg·kg-1=2.36 mg·kg-1。

3 结论

婴幼儿奶粉中左旋肉碱的含量为（36.23±2.36）mg·kg-1，P95=2。本实验采用液质联用同位素内标法，测定婴幼儿奶粉中的左旋肉碱含量。通过建立数学模型并计算，获得不确定度结果。从不确定度的评定过程可以看出，不确定度主要来源是左旋肉碱浓度的测定，而样品中左旋肉碱浓度的不确定度主要来源为标准曲线的测定。因此，我们在实验过程中，应严格控制实验条件，保证标准曲线的准确。