高效液相色谱法在酱油食品添加剂含量测定中的应用

摘 要：为验证酱油中食品添加剂是否符合国家标准限量要求，本文建立了高效液相色谱法测定市售酱油中安赛蜜、苯甲酸、柠檬黄、山梨酸、糖精钠、苋菜红、咖啡因和日落黄等8种食品添加剂的含量。结果表明，8种食品添加剂在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数均大于等于0.999 0；平均加标回收率在93.58%～98.27%，RSD＜2%；5种酱油中8种食品添加剂含量均符合国家限量要求。本方法操作简单、反应速度较快，且准确性较高，可用于食品添加剂快速筛查。

关键词：高效液相色谱法；酱油；食品添加剂；含量测定

Application of High Performance Liquid Chromatography in the Determination of Soy Sauce Food Additives

ZHAO Qianru

（Weishan County Inspection and Testing Center， Jining 277600， China）

Abstract： In order to verify whether food additives in soy sauce meet the national standard limit requirements， a HPLC method was established to determine the contents of 8 food additives in soy sauce， such as acesulfame， benzoic acid， lemon yellow， sorbic acid， saccharin sodium， amaranth red， caffeine and sunset yellow. The results showed that the 8 food additives had good linear relationships in their linear ranges， and the correlation coefficients were all greater than or equal to 0.999 0; the average recoveries were 93.58%～98.27%， RSD＜2%; the contents of 8 food additives in 5 kinds of soy sauce all meet the national limit requirements. This method has the advantages of simple operation， fast reaction speed and high accuracy， and can be used for rapid screening of food additives.

Keywords： high performance liquid chromatography; soy sauce; food additives; content determination

酱油也叫豉油，是由小麦、大豆、食用盐等原料经过发酵等工序制作而成的一种调味品，因其独特的风味、色泽以及丰富的营养价值，已成为人们饮食制作中极为重要的调味品之一。酱油以咸味为主，有提香、提鲜等作用，成分比较复杂，包括食用盐、氨基酸、糖类和各种有机酸类、色素等，用以改变菜肴色泽、提升菜肴味道[1-2]。

近些年，由于人们对食品安全问题关注度的提升，食品中添加剂的使用也已经成为人们关注的热点问题之一，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中针对食品添加剂的使用种类、条件等进行了明确规定，且为保证人们的身体健康，相关标准对各种食品添加剂的最大允许使用量也进行确切要求，一旦食品添加剂含量超过国家标准要求，则很有可能引发食品安全问题。例如，苯甲酸防腐剂有抑制细菌、真菌和霉菌生长等作用，但当其含量超标时，会影响人体对维生素、钙的吸收，并引发肾功能异常、肝脏代谢功能紊乱等，对人体骨骼生长产生不良影响。

目前，常采用气相色谱法、液相色谱法、紫外-可见分光光度法、液相色谱-质谱法以及气质联用法等进行食品添加剂测定，其中高效液相色谱法不仅操作简单方便，还具有分析速度快、质谱灵敏度较高、分离效率较高等优点[3-4]。鉴于此，本文通过建立高效液相色谱法，对酱油中8种食品添加剂含量进行测定，旨在保证市场酱油食品安全和品质提供技术保障和支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙醇（色谱纯，美国Fisher公司）；乙酸铵、山梨酸和苯甲酸（国药集团化学试剂有限公司）；安赛蜜、苯甲酸、柠檬黄、山梨酸、糖精钠、苋菜红、咖啡因和日落黄（上海源叶生物科技有限公司）；市售5种酱油；实验室自制超纯水。

1.2 仪器与设备

1100 series高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；5510OE-DTH超声波清洗仪（上海必能信超声有限公司）；3-18KS高速台式冷冻离心机（德国Sigma公司）；TE612-L电子天平（赛多利斯公司，感量0.01 g）；TU-1810PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；JHBE-50T闪式提取器（河南智晶生物科技发展有限公司）；PALL Cascada LS型超纯水系统（美国PALL公司）；PHS-3C精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；CW-2000超声波协同萃取仪（上海新拓分析仪器科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 配制标准溶液

分别称取10 mg苯甲酸、落日黄和山梨酸，20 mg苋菜红、安赛蜜和咖啡因，100 mg糖精钠，60 mg柠檬黄，经超纯水溶解后，定容至100 mL容量瓶，于4 ℃环境贮存备用，配制质量浓度为1 000 μg·mL-1的混合标准储备溶液各40 μL。

分别对标准储备液进行逐级稀释，配制成20.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、2.50 μg·mL-1和1.25 μg·mL-1的混合标准使用液，于4 ℃环境贮存备用。根据谱图中的保留时间对其进行定性分析，通过峰面积对其进行定量分析，每个稀释梯度各测定3次，取平均值，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 样品前处理

分别取各酱油样品2 mL，将其添加到10 mL容量瓶内，使用95%乙醇进行定容，摇匀后静置10 min，将各样品酱油中的添加剂进行振荡提取10 min、超声提取10 min，使用滤纸过滤。各取5 mL过滤液，放置于10 mL容量瓶内，向其中加入超纯水进行稀释定容，使用0.45 μm滤膜进行过滤，留存待测。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：Diamon⁃sil Plus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙酸铵（20 mmol·L-1，pH=7.0）；检测波长：230 nm；梯度洗脱，洗脱程序见表1。

2 结果与分析

2.1 条件优化

2.1.1 波长确定

根据HPLC检测结果发现，HPLC紫外检测波长为230 nm时，8种食品添加剂出峰效果理想，且能够完全分离；波长为220 nm、250 nm时，苯甲酸、糖精钠和安赛蜜有重叠情况，分离度比较差，故本文选择230 nm作为检测波长。

2.1.2 确定色谱柱和柱温

为验证最佳色谱条件，本实验对比了Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）和HC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），进样量均为5 μL，配备紫外检测器，分别进行HPLC测定。结果发现，采用Diamonsil PIus-C18柱时，8种食品添加剂可呈对称峰型，能够完全分离，且保存时间理想，其他色谱柱存在色谱峰拖尾、峰型不对称、保留时间较长等现象，故本文选择Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）作为实验色谱柱。

本文对比柱温分别为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃时对检测效果的影响。发现柱温为30 ℃时，峰型良好，食品添加剂可完全分离，无拖尾现象，其余柱温下分离效果较差、有峰重叠、保留时间较短、基线漂移以及噪音增大等现象，故选择30 ℃作为实验柱温。

2.1.3 确定流动相

考察流动相分别为甲醇-乙酸铵（20 mmol·L-1）、甲醇-磷酸二氢钾（20 mmol·L-1）、乙腈-乙酸铵（20 mmol·L-1）、乙腈-磷酸二氢钾（20 mmol·L-1）时对分离效果的影响。结果表明，甲醇-乙酸铵作为流动相时，峰型较好、分离速度较快，其余分离效果不理想，物质保留时间较短，有峰重叠，故本文选择甲醇-乙酸铵作为流动相。

2.1.4 确定洗脱方式

实验发现，由于流动相中甲醇体积分数的增加，物质保留时间有所下降，当采用等度洗脱方式时，山梨酸、糖精钠无法被有效分离[5]，而当降低甲醇体积分数时，虽然能够将二者分离，但洗脱时间超过60 min。因此，本文选用梯度洗脱方式，洗脱程序见表1。

2.1.5 确定缓冲溶液pH值

配制浓度为20 mmol·L-1的磷酸二氢钾和乙酸铵缓冲溶液，在不同pH（4.5、5.5、6.0、6.6和7.0）缓冲液下进行实验[6]。pH值为7.0时，8种食品添加剂分离效果理想，峰型较好，无拖尾现象。故本文选择pH值为7.0。

2.1.6 确定流速

考察流速为0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1时对分离效果的影响，结果发现当进样量为5 μL，流速为1.0 mL·min-1时分离效果较为理想，因此本次试验最终选择的流速为1.0 mL·min-1。

2.2 线性关系、检出限、定量限

为避免和减小误差，在最佳色谱条件下，重复多次进样，计算8种食品添加剂的检出限、定量限和线性范围，得出各食品添加剂的线性方程和相关系数（表2）。其中，方法检出限和定量限根据国家标准《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）中相关要求，采用信噪比法进行确定，测定10次，取平均值，检出限平均测定结果信噪比（S/N）均＞3，定量限平均测定结果信噪比（S/N）均＞10。由表2可知，8种食品添加剂在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数均≥0.999 0。

2.3 加样回收实验

根据1.3.3处理，采用外标法定量，计算加标回收率。由表3可知，8种食品添加剂的加标回收率在93.58%～98.27%，RSD在0.8%～1.3%，说明该检测方法准确性较高，稳定性理想，可用于酱油中食品添加剂含量的日常测定工作。

2.4 样品测定结果

采用上述方法对5种酱油样品中的8种食品添加剂含量进行测定，测定结果见表4。根据我国《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中关于食品添加限量要求，5种酱油样品中食品添加剂的含量均在国标允许范围内，未出现超标的现象。

3 结论

本文采用高效液相色谱法测定酱油中8种食品添加剂含量，其最佳测定条件为Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、流动相为甲醇-乙酸铵（20 mmol·L-1，pH=7.0），检测波长230 nm。该条件下各添加剂在各自的线性范围内线性关系良好，平均加标回收率在93.58%～98.27%，RSD＜2%，且5种酱油样品中食品添加剂含量均符合国家标准要求，未发现超标情况。说明高效液相色谱法可用于多种食品添加剂测定，操作简单、准确性较高。

参考文献

[1]史海慧，刘香英，孙洪蕊，等.传统酿造酱及酱油中微生物酶系研究进展[J].中国调味品，2024，49（2）：216-220.

[2]朱青，曹美萍，张继春.液相色谱法和液质联用法应用于酱油中三氯蔗糖测定能力验证的结果与分析[J].食品与发酵科技，2023，59（6）：155-160.

[3]国阳，张鹤之.浅析高效液相色谱及液相色谱-质谱联用技术在食品检测中的应用[J].现代食品，2023，29（22）：80-82.

[4]王春蕾，戴丽，李冰冰，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定现制茶饮中7种食品添加剂[J].江苏预防医学，2023，34（5）：521-523.

[5]刘群，曹倩蕾，冯彦勇，等.高效液相色谱法测定食品中丙酸钠､丙酸钙的含量[J].现代食品，2023，29（18）：145-147.

[6]李晓芹，金尉，袁小美.GC-MS内标法测定发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量[J].中国调味品，2017，42（6）：135-138.

作者简介：赵倩薷（1990—），女，山东微山人，本科，助理工程师。研究方向：食品检测。