李东阳, 白 玉, 郭 澳, 马文彬
肠道菌群(intestinal flora)是在人类胃肠道中与宿主存在共生关系的细菌和其他微生物[1],其参与机体的生理和病理调节,在人体免疫系统和代谢中发挥着重要作用。肠道和中枢神经系统可以通过肠-脑轴起到双向调节作用[2]。慢性失眠的主要临床表现为入睡困难、睡眠时间减少、睡眠中频繁觉醒等,并且随年龄的增加逐渐加重[3]。失眠的发病机制尚未完全阐明,近年来有研究发现肠道菌群在睡眠调节中扮演着重要角色[4],肠道菌群可以通过肠-脑轴的免疫系统、内分泌系统和迷走神经通路影响中枢神经的各项功能[5],进而对机体的睡眠过程进行调节。迄今为止,慢性失眠与肠道菌群之间关系仍需要进一步探索。本研究结合16S rDNA扩增子测序和生物信息学分析,首次检测鲁北地区健康参与者和失眠患者之间肠道微生物群的相关性和差异性,拟在探讨失眠患者的肠道分类群组成的差异和潜在关系,为肠道菌群在失眠中的临床应用提供新依据。
1.1 研究对象 2022年1月—7月就诊于滨州医学院附属医院神经内科门诊的慢性失眠患者30 例,患者来自滨州、东营和德州地区,年龄在18~65 岁之间。健康人群33 例为对照,志愿者从滨州医学院附属医院神经内科门诊及公众招募。本实验经过滨州医学院附属医院伦理委员会批准(批准号:LW-13),在被告知权利和义务后,所有参与者都完全理解了实验的益处和风险,并签署了知情同意书。所有参与者均符合严格的纳入标准和排除标准,并由2 名神经内科医生进行问卷及专科评估。研究参与者的粪便样本均在门诊就诊当天用无菌器械采集,然后保存在-80℃的冰箱中准备16S rDNA 测序。研究参与者还需要完成一份描述人口统计学和生活方式特征的问卷,缺少或无法确认的人口统计学数据(年龄、种族或性别)、BMI 被排除在研究之外。最后,将63 名确认2 周内未使用抗生素的合格志愿者分为两组(慢性失眠组和正常对照组),两组间BMI差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 16S rDNA 测序 北京诺和致源科技股份有限公司提供粪便样本扩增子测序技术服务。利用ZR粪便DNA试剂盒从患者粪便中提取细菌DNA,用Illumina HiSeq 2500 测序仪的优化引物组对覆盖16S rDNA基因V3~V4区的多重扩增子文库进行PCR扩增。
1.3 生物信息学分析 对测序后的序列进行预处理,产生双端合并序列,并使用软件Vsearch(v2.18.0)去除重复序列,使用软件Usearch(v11.0.667)降噪算法unoise3 产生ASV,去除嵌合体,使用软件Vsearch (v2.18.0)进行物种注释,使用的数据库为 RDPv18(细菌、古菌16s)或UNITE 25.07.2023(真菌ITS),最后使用软件R(v3.5.2)语言进行抽平、统计和作图,包括绘制主坐标分析(Principal Coordinats Analysis, PCoA)和相关性热图,通过计算UniFrac 距离来估计β 多样性,通过LEfSe分析对所有分类水平进行差异分析,识别组内组间物种丰度差异,来检测两组间的差异丰富分类群,统计抽平后样本扩增子序列变异(ASV),获得每个样本的微生物群落的具体组成,对两组在门、纲、目、科、属水平的物种进行可视化处理,并使用R 包“randomForest”进行随机森林分析。
2.1 失眠患者较正常人群存在肠道菌群的结构和功能的显著变化 分别计算了慢性失眠(IN)组和正常(HC)组ACE、Chao1、Shannon 和Simpson 指数,反映了两组间的α 多样性,且存在肠道微生物多样性的改变(见图1)。此外,基于Bray-Curtis 距离的β 多样性分析表明,失眠(IN)组和正常(HC)组在空间距离的第一维度上存在显著的结构差异(见图2)。通过线性判别分析效应大小(LDA EFfect Size,LEfSe)分析显示两组的相对丰度存在显著差异,尤其是梭状芽孢杆菌、厚壁菌门等菌属(见图3)。基于picrust2 功能基因预测结果表明,慢性失眠组和正常组的肠道菌群功能相关基因无显著区别。对测序后物种从门、纲、目、科、属水平上进行了相对丰度分析,我们发现在门水平,相对丰度最高的菌群包括梭杆菌门、拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、疣微菌门等(见图4)。
图1 慢性失眠(IN)组和正常对照(HC)组的α多样性分析
图2 基于Bray-Curtis距离的β多样性分析
图3 LDA EFfect Size分析
图4 门水平上物种相对丰度分析
2.2 通过随机森林分析识别与失眠症相关的肠道微生物群 传统的方法,如LEfSe 分析,通过比较各组之间肠道菌群相对丰度的差异,鉴定的生物标志物建立疾病诊断的预测模型比较困难。为了改进生物标志物的识别,我们采用随机森林分析,在考虑最低误差率加标准偏差的情况下,鉴定最佳的物种生物标志物。其中,ASV_17(毛螺菌科)是慢性失眠组和正常分组贡献最高的ASV(见图5)。
图5 随机森林分析
健康成年人肠道中的菌群种类和数量十分庞大,大约包括1 000 多种菌群,细菌的总数则超过了100 万亿,肠道菌群主要包括厚壁菌、拟杆菌、放线菌、疣微菌和变形菌等五个菌门,其中主要为厌氧菌[6]。大量证据表明,睡眠在保护人类健康、恢复身体功能、增强免疫力、保护大脑健康等方面均发挥着十分重要的作用[7],并可以通过肠-脑轴与肠道菌群建立联系。
到目前为止,有关睡眠不足对人体肠道微生物群组成的影响的研究并不多见,曾有研究对大鼠行7 d的睡眠限制后,并未检测到主要微生物种群的改变[8]。Poroyko等[9]在研究中发现,对小鼠行4周的睡眠剥夺后可明显观察到体内肠道微生物群的变化。有证据表明,随着睡眠剥夺时间的不断延长,人类肠道微生物群的受到的影响程度会逐渐增强。针对连续数个晚上保持2 h 以内睡眠的实验会降低肠道微生物群的丰富度,并且α 多样性的相对丰度增大[10],而在另一项研究中,将睡眠时间延长到每晚4 h后则对β多样性没有产生影响[11]。
迄今为止,对于睡眠障碍可以具体改变肠道微生物群的哪些细菌种类的结论尚未完全一致[9]。在睡眠中断的小鼠中,厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加[12],梭状芽孢杆菌科和毛螺菌科的相对丰度也发生相应改变[13],并且毛螺菌科种群数量的增加或减少还可能和肠道的不同部位有很大关系[14]。另一方面,一项对37 名老年人进行的横断面研究发现,更好的睡眠质量则与疣状梭菌门比例相关[15]。本次实验通过LEfSe 分析(判断标准LDA 值>3.0,P<0.05)观察到鲁北地区慢性失眠(IN)组中梭杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等一些菌属的相对丰度与正常组存在统计学差异(P<0.05),同时通过随机森林分析发现,毛螺菌科种群数量在鲁北地区慢性失眠人群中显著增加,这些发现更进一步丰富了失眠对肠道菌群组成影响的研究。有研究表明睡眠可以影响到肠道菌群的代谢功能,睡眠破碎可能导致产生丁酸的细菌的丰度减少,并进一步影响丁酸代谢[16]。Christian等[13]在正常体重个体中进行了一项研究,评估睡眠不足对人类肠道微生物群的影响,发现两天的短期睡眠剥夺可以降低胰岛素敏感性,间接影响了人体的糖代谢能力,因此我们可以推测慢性失眠患者和健康人体内与衰老、抗药性、氨基酸代谢等功能基因相关的菌群种属相对丰度或许也存在差异,本次基于picrust2 功能基因预测结果并未显示出慢性失眠组和正常组的肠道菌群功能相关基因的显著区别,可能存在样本量较小和地区差异等限制因素。
失眠症是否直接导致肠道微生物群的微生态失调尚不清楚。随机森林分析等统计方法能够以较高的预测精度和预测效率识别特征生物标志物,尤其适用于基于肠道微生物群的疾病预测和诊断。本研究中随机森林模型确定了一个关键的细菌分类群(毛螺菌科),它不仅与临床数据密切相关,而且在肠道生态网络中起着关键作用,可作为识别失眠患者的潜在生物标志物。
本研究中利用前沿的生物信息学算法,证明了失眠与正常健康之间的差异,反映了鲁北地区失眠人群的微生物群落组成。本研究表明失眠人群存在肠道微生物多样性的改变,鲁北地区失眠人群存在梭杆菌门、厚壁菌门及拟杆菌门的丰度相对的改变,而且我们也确定了毛螺菌科作为潜在生物标记物的可能性,虽然上述方法仅基于生物信息学分析,但结果具有一定的参考价值,后续研究可扩大样本量进一步验证。这将为利用肠道微生物群的信息开发新的治疗策略,打开新的视角。
伦理学声明:本研究方案经由滨州医学院附属医院伦理委员会审批(批号:LW-13),患者均签署知情同意书。
利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明:李东阳负责设计论文框架、起草论文;白玉负责数据收集、统计学分析、绘制图表;郭澳负责实验操作、研究过程的实施;马文彬负责拟定写作思路、指导撰写文章并最后定稿。