“仪器分析”课程中案例式教学的探索和应用

王文静

（中南民族大学 药学院，湖北 武汉 430074）

引言

高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，采用高压输液系统，以不同极性的单一或混合溶剂作为流动相，利用高效色谱柱对待测物质先分离再进行检测的一类仪器分析方法。该方法具有高效﹑高灵敏度﹑快速﹑易于自动化的特点，在医药卫生﹑食品质量与安全﹑石油化工﹑生理生化和环境保护等领域中具有广泛的应用。特别是在药学研究领域，高效液相色谱法是必不可少的一类仪器分析方法［1］。因此，“仪器分析”课程要求药学院学生能熟练掌握高效液相色谱法的基本理论知识并同时配备相应实验课程，帮助学生合理运用该方法对待测物质进行定性或定量分析。

高效液相色谱法作为“仪器分析”课程中色谱分析法的一个重要组成部分，其涉及的理论知识面很广，包括色谱法的基本概念﹑流动相的种类及洗脱能力﹑色谱流出曲线﹑色谱分离原理﹑色谱分离方程以及液相检测器等。在实际教学过程中，由于《高效液相色谱法》章节中涉及大量计算方程式和相关参数，且部分参数表示方式很接近，如分配系数K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度，分配比k=溶质在固定相中的质量/溶质在流动相中的质量。这导致学生在学习过程中容易对公式混淆﹑记忆困难。另外，高效液相色谱法作为最常用的仪器分析方法之一，其重难点是如何设计适当的色谱条件对待测物质进行分离。需要根据待测物质的物理或化学性质，选择不同分离原理色谱柱﹑流动相体系及比例﹑流速﹑检测器等，在最短时间内达到完全分离。虽然在对应的实验课程中设计了“利用高效液相色谱法检测不同厂家双黄连口服液中黄芩苷含量”的实验，但该实验只是一个验证性实验，主要进行定量分析。实验中流动相体系及比例﹑流速﹑色谱柱及检测器均已经确定，学生在实际操作过程中无法体会流动相洗脱能力的差异﹑流动相对分离度的影响﹑柱效与流速之间的关系﹑不同色谱柱分离原理以及不同检测器的适用范围，从而导致教学效果不理想。

案例教学法是以案例为基础的一类开放式﹑互动式的教学方法，起源于20世纪20年代，由美国哈佛商学院所倡导，于1990年之后在国内教育界开始探索［2］。该方法通过教师提供特定案例材料，学生阅读材料﹑查阅文献﹑积极探索﹑拟定解决方案，在课堂上进行分组或集中讨论，对不同解决方案进行对比分析，总结经验，最终达到强化记忆﹑熟练掌握知识点的效果。案例教学法鼓励学生独立思考，培养学生的自主思维，引导学生在解决问题的过程中掌握理论知识，通过共同探讨，调动学生的学习主动性，从而提高教学质量。

一、案例选择

案例是以教学为目的，具有典型性﹑客观生动性以及多样性的特点。好的案例必须紧扣对应的理论知识，并且来源于实践，而不是主观臆测和虚构的。同时，案例应该存在多种解决方案，可为学生提供充分的探索空间。《仪器分析》教材中高效液相色谱法部分的实例，往往是为了证明某些理论而给出的实验结果，忽视了方案设计及条件摸索的过程，使学生难以将结果与原理相结合。在国内外学术期刊中，每年都会有大量基于高效液相色谱法建立的分析方法，用于特殊物质的定性或定量检测。这些研究论文通常是根据待测物结构推测其物理或化学性质，设计检测方案并逐步优化，最终形成针对特殊物质的分析方法。可以将此类研究论文作为教学案例，以高效液相色谱法的核心问题“分离—检测”为导向，在课堂上进行分析讨论，培养学生文献查阅﹑实验方案设计﹑数据分析以及成果展示等各方面的能力。

二、教学案例——根据待测物质的性质选择不同的分离方法

高效液相色谱法的关键步骤是分离样品，根据分离机制的不同，可以分为吸附色谱法（adsorption chromatography）﹑分配色谱法（partition chromatography）﹑离 子色谱法（ion chromatography）﹑分 子排阻色谱法（size exclusion chromatography）﹑键合色谱法（bonded-phase chromatography）﹑亲和色谱法（affinity chromatography）［3］。

1.液-液分配色谱法的特点是固定相和流动相均为液体，通过化学反应将有机分子键合在担体表面，形成一层单分子薄膜，利用组分在固定液与流动相中溶解度的差异，实现分离。根据固定液与流动相的极性差别，将液-液分配色谱法分为正相和反相色谱法。正相色谱法以硅胶为担体，通过化学反应以氰基或氨基取代硅胶中的羟基形成固定相，选择正己烷等非极性溶剂作为流动相，固定相极性大于流动相极性，极性小的组分先流出色谱柱。适用于分离中等极性的组分，如芳香醇﹑芳香胺﹑甾族﹑脂和有机氯农药等。反相色谱法是将十八烷基﹑苯基或辛烷基等键合在硅胶上作为固定相，以水和溶于水的有机溶剂（乙腈﹑甲醇﹑乙醇等）作为流动相。极性小的组分在固定液中的溶解度大，后流出色谱柱。适用于分离非极性或中等级性的组分，如天然小分子化合物﹑同系统﹑烷烃﹑激素等。

环孢素A（Cyclosporine A,CsA）是真菌产生的具有11个氨基酸的环肽类化合物（如图1），溶于甲醇﹑乙醇﹑二氯甲烷﹑丙酮，微溶于水。临床上用于治疗器官和组织移植后的排异反应［4-5］。根据其脂溶性特点，选择液-液分配色谱法进行分析，采用反相C18（十八烷基键合硅胶）作为固定相，甲醇-水和乙腈-水体系作为流动相。结果表明CsA保留时间对有机相比例变化比较敏感，随着有机相比例降低，其保留时间明显增加，且甲醇-水体系变化比乙腈-水体系更明显。乙腈比例为75%～85%，甲醇比例为84%～88%，CsA的保留因子（k）控制在3～7范围内。

图1 Cyclosporine A、次黄嘌呤、黄嘌呤和番茄红素化学结构

2.液-固吸附色谱法以固体吸附剂为固定相，利用组分分子与吸附剂间吸附力的差异进行分离。常用的固体吸附剂有硅胶﹑氧化铝﹑活性炭﹑高分子多孔微球（有机胶）﹑分子筛及聚酰胺等。吸附色谱法中的流动相主要为非极性的烃类（如己烷﹑庚烷），可以加入某些有机溶剂（如甲醇﹑二氯甲烷﹑加酸）调节流动相极性的pH值，固定相极性大于流动相，为反相色谱。流动相极性越大，洗脱能力越强；组分极性越大，保留时间越长。吸附色谱法对异构体和具有不同官能团的化合物选择性较好，常用于分离相对分子量中等的油溶性物质。

番茄红素是植物性食物中存在的一种类胡萝卜素，广泛存在于番茄﹑西瓜﹑葡萄柚等水果中，为目前自然界中发现的最强抗氧化剂，同时还可以降低前列腺癌等多种肿瘤和心血管疾病发生的风险。其不仅作为食品加工的天然色素，且越来越多地应用于保健食品﹑药品和化妆品中。番茄红素为直链形碳氢化合物，具有11个共轭双键和2个非共轭双键（图1），结构稳定性差，具有多种顺反异构体。对其顺反异构体的分离和分析多采用常规的C8或C18色谱柱，但效果不理想，很难达到完全分离。李伟等［6］在前人研究的基础上，选择液-固吸附色谱法对番茄红素异构体进行分离。该方法选择Nucleosil 300-5（Macherey-Nagel）色谱柱，以正己烷为流动相，对不同样品中的番茄红素异构体实现较好分离。

3.离子交换色谱法是以硅胶为基体的化学键合离子交换剂或交联聚苯乙烯为基体的离子交换树脂为固定相，流动相为具有一定离子强度并对pH有一定缓冲能力的水溶液，利用被分离组分离子交换能力的差别或选择性系数的差别而实现分离。组分离子对固定相的亲和力越大，交换力越强，越容易交换到固定相上，保留时间也越长；反之，亲和力小的离子，保留时间短。离子交换色谱法主要用于分离离子和可离解的物质，如蛋白质﹑多糖﹑寡核苷酸﹑噬菌体﹑病毒等。

肌氨肽苷注射液是临床上用于治疗心血管疾病的常用药物。《中国药典》规定其中主成分次黄嘌呤的含量应为标示量的85%～115%。现行标准以C18为固定相，以磷酸二钾缓冲溶液（0.001 mol·L-1，pH 6.9）-甲醇（100∶0.2）为流动相，对次黄嘌呤含量进行测定。由于标准中有机相比例过低，导致待测物出峰时间太短，次黄嘌呤与其干扰物黄嘌呤的分离度很难达标，因此须要开发新方法对次黄嘌呤的含量进行测定［7］。由于化学结构不同（图1），在pH值为2.5的水溶液中，次黄嘌呤会发生解离，约38%以正离子存在，而黄嘌呤则不会解离，仍为中性分子。因此，白璧炜等［8］根据两者的不同性质，选择离子交换色谱法对次黄嘌呤含量进行测定。采用磺酸基阳离子交换键合硅胶为固定相，以水（0.001 mol·L-1稀硫酸调节pH为2.2﹑2.5﹑2.8和3.5）为流动相。结果显示，pH值为2.5时，色谱峰宽最窄﹑理论塔板数最高且出峰时间较快。因此，该方法的最适条件为pH=2.5±2.0。与现行标准相比较，新方法稳定性好﹑干扰少﹑分离度高，且无须配制对照品进行系统适应性试验，节省时间和成本。

4.分子排阻色谱法又称为凝胶色谱法，是目前最常用的分离技术之一。分离原理主要是以具有一定孔径分布的多孔凝胶填料作为固定相，依靠待测样品的分子尺寸与凝胶孔径间的关系进行分离。大分子组分难以进入凝胶孔径内，只能随流动相在填料间隙移动，最先洗脱出来；中等大小的组分可以通过较大的孔径进入凝胶填料内部，在柱中滞留，较慢洗脱出来；小分子组分可以进入凝胶填料的大部分孔径，滞留作用更强，最后洗脱出来。该方法具有保留时间短﹑谱峰窄﹑柱寿命长﹑生物相容性好等特点，广泛用于大分子的分级和大分子物质（如核酸﹑蛋白质﹑油脂和多糖）的分离。

淀粉是由葡萄糖分子通过糖苷键聚合而成的大分子物质，经过机械﹑化学或生化工艺的加工，广泛应用于食品﹑医药﹑纺织及造纸等领域［9］。葡聚糖是淀粉的酶解产物之一，窄相对分子质量分布范围的葡聚糖在临床上有很高需求。已有报道称相对分子质量增大及分布不均匀会引起右旋糖酐注射液的过敏反应［10］。《中国药典》自2000年版起规定以相对分子质量与相对分子质量分布测定法对右旋糖酐注射液质量进行控制。因此，需要一种能够准确﹑快速测定淀粉降解产物相对分子质量的方法来衡量产品质量。刘艳群等［11］于2005年发表了一篇关于运用凝胶渗透色谱法（GPC）测量淀粉酶解产物分子量的研究论文。淀粉经过淀粉酶酶解，许多长链﹑大分子的多糖被水解成了小分子，不同分子量组分进入凝胶孔的机会有所差异，最终达到以长链分子在前﹑短链分子在后的顺序从柱中淋洗出来的目的，之后这些组分以谱带形式进入示差折射检测器进行检测，通过与标准品所绘制的标准曲线对比计算出样品分子量。该方法重复性好，可以用于淀粉酶解反应的监控和指导淀粉制品的加工。

5.亲和色谱是一种利用固定相的结合特性来分离物质的色谱方法。该方法将能与待分离物质发生可逆吸附的生物大分子（抗原/抗体﹑酶﹑受体蛋白﹑细胞膜等）通过一定技术手段与固定相载体相偶联，以此作为固定相填充色谱柱。当含有待分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，样品中存在的亲和配基与偶联的生物大分子发生特异性结合，产生滞留。而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中快速流出，从而实现对目标成分的选择性分离。

黄芪甲苷（Astragaloside IV）具有增强免疫力﹑降血糖﹑强心降压﹑抗肿瘤和抗衰老等多种药理活性，是中药黄芪的药效物质基础之一，用于评价黄芪及其制剂质量［12］。《中国药典》（2000年版）规定采用高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLCELSD），以C18为填充剂，乙腈-水（32∶68）作为流动相，对黄芪甲苷含量进行测定。但该方法对仪器设备要求较高，且样品预处理工序烦琐，不适于大批量样品的快速检测。于生兰［13］基于抗原抗体反应的特异性，建立了一种快速﹑准确﹑灵敏的黄芪甲苷免疫分析检测方法。首先通过合成的黄芪甲苷人工抗原诱导小鼠产生特异性抗体，利用黄芪甲苷与载体结合制备成的免疫亲和色谱柱，靶向分离纯化得到单克隆抗体，建立黄芪甲苷间接竞争酶联免疫吸附法，用于黄芪甲苷的含量测定［14］。同时，在本研究的基础上，还可以选择抗AST单克隆抗体作为配基，制备免疫亲和色谱柱，用于黄芪甲苷的特异性分离和纯化，为黄芪及其制品的研究提供基础。

为进一步强化学习效果，提升学生对高效液相色谱法不同分离机制的理解，可以根据选择的案例，制订如下教学方案：（1）学生分组。按照授课人数，将学生平均分为6～8组。（2）课题设计。根据待测物质的不同性质以及实验要求，设计四个研究课题，帮助学生掌握不同的分离原理及检测方式。人参中不同人参皂苷的分离纯化，牛初乳加钙咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量测定，磷酸硝酸溶液中钙﹑镁﹑铁﹑铝离子的分离，头孢克肟颗粒中聚合物的含量测定。（3）分析方法设计。学生以小组为单位，选择一个课题研究。利用课余时间查阅文献，通过分析待测物性质及实验要求，设计一个或多个合理的分析检测方法。（4）汇报讨论。每个小组推选一名学生，以PPT的形式对本组设计的实验方案进行展示，其他学生提问并评价其合理性。

通过案例教学，可以锻炼学生查阅文献﹑设计实验及团队合作等各方面的能力，为今后的工作及科研提供助力。同时，在自主学习﹑解决问题的过程中，进一步加深学生对课堂知识的理解，并能举一反三﹑灵活运用。

三、教学方法探索

只有“仪器分析”课堂教学足够生动活泼，才能够激发学生的学习兴趣，从而提升学生的学习自主性，这不仅需要从课堂内容下功夫，还要从授课方式上双管齐下，助力培养能够真正推动社会发展的新型人才。下面就“仪器分析”课堂教学方法进行探讨，以推进高校课堂“双一流”建设。

首先，学生在课堂中能充分表达意见和想法，在思考中碰撞出思维的火花，能够让学生在课堂教学中充分发挥主观能动性。在课前布置学习任务，促进学生自主学习，在课堂教学中充分尊重学生的主体地位，争取把课堂还给学生。如在《绪论》章节教学中，教师可以组织学生进行“仪器分析与我们日常生活的联系”小组讨论，列举日常生活和工作中接触到的分析仪器及其作用；探讨仪器分析的发展现状及存在的问题与挑战。

其次，近年来新的仪器分析方法及检测技术均得以迭代升级，虽然基本的分析方法原理依然适用，但是教材中仍存在大量关于老旧仪器构造的内容，课堂授课内容结合不同专业的需求，将相关科研成果融入课堂，注重跟踪相关新技术﹑新方法，紧跟时代步伐将其反映在教学中。以高水平科学研究支撑高质量人才培养，定制具有专业特色的课堂。

同时，“仪器分析”是一门理论与实践并重的课程。因此，在理论授课之外，实践教学也占有重要的地位。从专业特色出发设计应用实例，课堂知识紧密联系生产实际，最终形成“思考—理论—实践—解决实际问题”的综合授课模式。

结语

目前，本科生的理论课程学时短﹑知识面广，而实验教学多为验证性实验，学生不能对实验原理进行深入了解，无法将理论知识与实际操作相结合。案例教学是一种教师提出案例材料，学生查阅文献﹑互相讨论的模式，让学生既能掌握基础专业知识，也能提高解决实际问题的能力。有效提高学生的科学素养，为日后的发展奠定基础。