自制输血相容性检测低值阳性质控品的方法学建立

李璐 孙晓琳 魏俊杰 刘瑞琪 吴伟鑫 刘海云 张印则

(深圳大学总医院 输血科，广东 深圳 518000)

根据《医疗机构临床实验室管理办法》《医疗机构临床用血管理办法》《临床用血质量控制指标(2019 年版)》《医学实验室质量和能力认可准则(CNAS-CL02:2023)》及《输血相容性检测标准》等要求，临床实验室应使用质控品对检测项目进行室内质量控制，评价检测体系的有效性、可靠性，保证试验结果准确可信。 输血相容性检测项目均为定性检测，应使用弱阳性质控品对检测体系有效性、可靠性进行监测，以敏锐地发现检测体系的细微变化，同时质控品应能检出IgM 型抗体和IgG 型抗体[1-2]。 目前市售的国内外输血相容性检测室内质控品多为强阳性，难以敏锐地发现检测体系的变化，易导致假阴性结果。 因此，本实验室使用自制低值阳性质控品，对实验室检测体系进行质量监测。 报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2023 年本院5 份DAT(-)B/RhD(-)E(-)和A/RhD(＋)E(＋)的健康体检者EDTA 抗凝标本，以及30 份意外抗体筛查阴性的健康体检者EDTA 抗凝标本和促凝标本。

1.2 仪器与试剂

IgM 型抗-A 和抗-B 血型定型试剂(批号:20211220)、IgM 型抗-E 血型定型试剂(批号:20233201)、IgG 型抗-D 血型定型试剂(批号:20230627) 均为上海血液生物医药公司产品。ABO/RhD 血型检测卡(批号:23007.01)、抗球蛋白检测卡(批号:23067.01)、低离子溶液(LISS)(批号:23003.01)均为西班牙Grifols 公司产品。 人ABO 血型反定型用红细胞试剂盒(批号:202308011)、意外抗体筛查细胞(批号:202308007)均为江苏力博医药公司产品。 红细胞保存液(批号:20230801)、抗体稀释液(批号:20230801)均为深圳市爱康试剂有限公司产品。 全自动血型及配血系统(Erytra，西班牙Grifols 公司)、血清学离心机(KA-2200，日本Kubota 公司)。

1.3 质控品配制

1.3.1血型质控品

正定型:1、2 号质控品分别各加入B/RhD(-)E(-)、A/RhD(＋)E(＋)压积红细胞1 mL。 反定型:1、2 号质控品分别各加入红细胞保存液4 mL，分别加入适量IgM 型单克隆抗-A 和抗-B，使其微柱凝胶法凝集强度达到1＋。 根据RhD 阴性个体的表型分布频率，大多数RhD 阴性人群Rh 分型为Rh dccee，根据血型ABO、RhD、RhE 抗原互补原则设计多种配伍方式，以相对不易获取的RhD(-)E(-)红细胞为1 号管，按照血型抗原互补原则配伍选择RhD(＋)E(＋)为2 号管，如A/RhD(-)E(-)与B/RhD(＋)E(＋)；O/RhD(-)E(-)与AB/RhD(＋)E(＋)；AB/RhD(-)E(-)与O/RhD(＋)E(＋)。

1.3.2意外抗体筛查质控品

3、4 号质控品分别各配制血浆4 mL、血清4 mL、抗体稀释液4 mL、血浆2 mL＋抗体稀释液2 mL、血清2 mL＋抗体稀释液2 mL 等5 种不同介质，分别加入适量IgM 型单克隆抗-E 和IgG 型单克隆抗-D，使其相应阳性抗筛细胞微柱凝胶法凝集强度达到1＋。

1.4 质控品定标

1)血型质控品。 1、2 号质控品对ABO 正反定型、RhD 血型鉴定反应体系进行监测。 2)意外抗体筛查质控品。 3 号、4 号为弱阳性质控品，2 号为阴性质控品，对意外抗体筛查反应体系中IgM 和IgG类抗体进行监测。 3)交叉配血质控品。 以3 号质控品为受血者，1、2 号质控品分别为供血者，进行交叉配血，监测IgM 型抗体。 以4 号质控品为受血者，1、2 号质控品为供血者，进行交叉配血，监测IgG 型抗体。

1.5 稳定性监测

分别于d1、d2、d5、d10、d15、d20、d25 和d30 对1～4 号质控品，按质控规则进行血型鉴定、意外抗体筛查、交叉配血检测并记录结果。

1.6 重复性监测

对1、2 号质控品及保存介质为抗体稀释液的3、4 号质控品各1 支，按质控规则连续进行20 次血型鉴定、意外抗体筛查、交叉配血检测并记录结果。

1.7 统计学分析

根据AABB 技术手册，凝集强度4 ＋、3 ＋、2 ＋、1＋、1＋w、±、-赋值为12、10、8、5、4、2、0 分。 使用IMB SPSS Statistics 22 软件对数据进行分析，所得数据采用均值±标准差(±s)形式表示，相同介质组内比较变异系数(CV)；不同介质组间比较采用单因素方差分析方差齐Tukey 检验进行差异分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗体用量

2.1.1血型质控品

1、2 号质控品分别各加入红细胞保存液4 mL，分别加入IgM 型单克隆抗-A 2 μL(1＋∶2 048)和抗-B 4 μL(1＋∶1 024)使其凝集强度达到1＋。

2.1.2意外抗体筛查质控品

3、4 号质控品分别各配制血浆4 mL、血清4 mL、抗体稀释液4 mL、血浆2 mL＋抗体稀释液2 mL、血清2 mL＋抗体稀释液2 mL 等5 种不同介质，分别加入IgM 型单克隆抗-E 2 μL(1＋∶2 048)和IgG 型单克隆抗-D 2 μL(1＋∶2 048)使其相应阳性抗筛细胞凝集强度达到1＋。

2.2 靶值定标

使用表型Ⅰ:Rh DCCee、Ⅱ:Rh DccEE、Ⅲ:Rh dccee 的意外抗体筛查细胞进行质控品定标检测，微柱凝胶法质控品定标结果见表1。

表1 室内质控定标结果Table 1 Results of internal quality control calibration

2.3 稳定性监测

2.3.1血型质控品

分别在d1、d2、d5、d10、d15、d20、d25 和d30 对1 号管和2 号管进行血型鉴定，进行稳定性分析，结果见表2。 低值阳性抗体凝集强度评分情况见图1。

图1 血型质控品低值阳性抗体凝集强度评分Figure 1 Score of agglutination intensity of weakly positive antibody for blood group quality control products

表2 血型质控品稳定性评价评分统计Table 2 Statistics of stability evaluation score of blood type quality control product

2.3.2意外抗体筛查质控品

分别在d1、d2、d5、d10、d15、d20、d25 和d30 对5 种不同抗体保存介质的低值阳性意外抗体筛查质控品3、4 号管中IgM 型抗-E 和IgG 型抗-D 进行稳定性监测，根据AABB 技术手册，凝集强度1＋赋值为5 分。 其中抗体稀释液保存介质与其他4 组介质稳定性差异有统计学意义(F＝11.35，P＜0.05)，结果见图2。 低值阳性抗体在抗体稀释液介质中凝集强度评分情况见图3。

图2 意外抗体在不同保存介质中凝集强度评分Figure 2 Agglutination intensity scores of unexpected antibodies in different preservation media

图3 意外抗体筛查质控品低值阳性抗体在抗体稀释液介质中凝集强度评分Figure 3 Score of agglutination intensity of weakly positive antibodies of unexpected antibody screening quality control products in antibody diluent medium

2.3.3交叉配血质控品

分别在d1、d2、d5、d10、d15、d20、d25 和d30 对5 种不同抗体保存介质的3 号管和4 号管分别与1号管和2 号管进行交叉配血稳定性监测，根据AABB 技术手册，凝集强度1＋赋值为5 分，其中抗体稀释液保存介质与其他4 组介质稳定性差异有统计学意义(F＝7.66，P＜0.05)，结果见图4。 抗体稀释液介质中交叉配血凝集强度评分情况见图5。

图4 交叉配血在不同保存介质中凝集强度评分Figure 4 Score of agglutination intensity of cross-matching in different preservation media

图5 抗体稀释液介质中交叉配血凝集强度评分Figure 5 Score of agglutination intensity of cross-matching in antibody diluent medium

2.4 重复性监测

对1、2 号质控品及保存介质为抗体稀释液的3、4 号质控品各1 支，按质控规则连续进行20 次血型鉴定、意外抗体筛查、交叉配血检测，结果见表3～4。

表3 血型质控品重复性评价评分统计Table 3 Statistics of repeatability evaluation score of blood type quality control products

表4 意外抗体筛查与交叉配血质控品重复性评价评分统计Table 4 Statistics of repeatability evaluation score of unexpected antibody screening and cross-matching quality control products

3 讨论

采用与日常待检标本相同的检测程序对质控品进行检测，通过质控品检测值与靶值之间的偏离程度，判断检测体系(试剂、设备、检测程序、人员操作等)的有效性与稳定性，从而推断出日常检测结果是否可信[3-4]。

弱凝集检出能力的质量控制在临床工作中至关重要[5]，在保证试验结果的准确性及保障临床用血安全方面有重要价值[6-7]。 通过血浆4 mL、血清4 mL、抗体稀释液4 mL、血浆2 mL＋抗体稀释液2 mL、血清2 mL＋抗体稀释液2 mL 以上5 种不同抗体保存介质分别在d1、d2、d5、d10、d15、d20、d25 和d30 对低值阳性质控品IgM 型抗-E 和IgG 型抗-D进行稳定性监测，抗体稀释液保存弱阳性抗体稳定性最强，AABB 技术手册将凝集强度1 ＋赋值为5分，抗体稀释液组得分为5.25±1.75。 血型质控品稳定性评价，ABO 血型抗原变异系数均为0，低值阳性血型抗体变异系数均＜10%。 可见，该质控品体系在30 d 内稳定性良好。 《标准物品/标准样本的使用指南(CNAS-GL04:2017)》对标准样品做了明确定义“具有一种或多种规定特性足够均匀且稳定的材料”。 可见，质控品的核心要求是定值稳定，并未对其形式做出明确限定，因此该质控品体系采用稳定性更强的抗体稀释液而非血浆作为弱阳性抗体保存介质。

根据《输血相容性检测室内质量控制的失控判定与处理专家共识》对于抗体筛查室内质控品设计推荐要求，使用有临床意义的特异性弱抗体(如抗-E、抗-Fya、抗-c)为低值阳性质控品，以确保检测的敏感性和试剂保存过程中红细胞抗原表达的完整性[8]。 根据室内质控品制备和使用要求[9-12]，该自制质控品体系充分考虑Rh 表型频率及抗原剂量效应配制4 支质控品对ABO/RhD 血型、意外抗体筛查(阴性/IgM 弱阳性/IgG 弱阳性)、交叉配血(阴性/IgM 弱阳性/IgG 弱阳性)进行全面质量控制。

该质控品体系选择使用低值阳性IgM 型抗-E和IgG 型抗-D 对意外抗体筛查及交叉配血反应体系进行监测，根据RhD 阴性个体的表型分布频率，大多数RhD 阴性人群Rh 分型为Rhdccee，以相对不易获取的RhD(-)E(-)红细胞为1 号管，按照血型抗原互补原则配伍选择RhD(＋)E(＋)为2 号管，如:B 型RhD(-)E(-)与A 型RhD(＋)E(＋)；A 型RhD(-)E(-)与B 型RhD(＋)E(＋)；O 型RhD(-)E(-)与AB 型RhD(＋)E(＋)；AB 型RhD(-)E(-)与O 型RhD(＋)E(＋)。 避免因RhD(-)红细胞标本较少而影响自制质控品配制和使用的问题。

在Rh 血型系统中，RhD 抗原性最强，其次为RhE、RhC、Rhc、Rhe 抗原，均具有明显的剂量效应[13]，其对输血相容性检测结果影响显著[14]。 为保障该质控体系中(3 号管)意外抗体筛查与(3 号管＋2 号管)交叉配血凝集强度的一致性，应充分考虑2 号管所用红细胞RhE 抗原的剂量效应，最终选用纯合子还是杂合子，取决于抗筛细胞性质，建议与抗筛细胞RhE 抗原性质保持一致。

输血相容性检测实验室需要通过质控品监测检测体系的准确性、稳定性及有效性，保障临床用血安全[15]。 该质控品体系经过1 年的使用，重复性及稳定性好、配制原料易获取、配制方法简单、实用性强，能灵敏地监测检测体系的有效性、可靠性。受技术条件的限制，目前技术无法制备出血型抗原弱阳性质控品，弱阳性抗原的人工制备尚待进一步研究。