miRNA 在糖尿病周围神经病变中的调控机制研究进展

王晓月，李捷，张璐璐，徐云生

（1.山东中医药大学，山东济南 250355；2.山东中医药大学第二附属医院，山东济南 250001）

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常见的微血管并发症，以对称分布的感觉异常为主要临床表现，DPN从远端开始逐渐向近端扩散，呈手套和袜子样分布，约50%的DM 患者会发生本症［1］。DPN可进一步发展为糖尿病足，难以愈合的糖尿病足会引发坏疽，进而造成截趾或截肢，截趾或截肢后创面常难以愈合，从而引发各种感染等。因此，阐明DPN致病机制，早期对其进行干预，预防其进展有重要意义。近年研究发现，微小RNA（microRNA，miRNA）的差异性表达与DPN的发病关系紧密［2-3］。因此，本文综述miRNA 调控DPN的机制研究进展，阐述如下。

1 miRNA概述

miRNA是一类高度保守的内源性、非编码单链小分子RNA，长度为18～25个核苷酸，通过调控特定m RNA靶标的转录、翻译和／或降解影响细胞功能［4］。一个miRNA可以同时靶向位于同一细胞信号通路的多个基因，miRNA 表达的任何变化都可能影响靶标调节的程度，从而影响细胞稳态。因此，miRNA 的相对水平及其靶标m RNA 在各种疾病中起重要作用。miRNA已被证实可以影响许多重要的生物过程，如细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育和细胞凋亡，失调的miRNA在衰老、心血管疾病和癌症等各种疾病的进展中起关键作用，如影响肿瘤的发生发展［5-6］。miRNA也可作为各种疾病和综合征诊断和预后的潜在生物标志物。

2 miRNA在DPN中的作用机制

研究表明，miRNA 可能通过调节神经炎症、疼痛刺激机制和细胞损伤与修复过程参与DPN 的发病［7-8］。

2.1 调节神经炎症 CHANDRAMOORTHY H C等［9］在DPN患者和相关动物模型中发现，周围神经周围的微血管中存在炎症细胞因子［如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-8等］的异常表达。TNF-α作为细胞信号蛋白参与全身炎性反应，也是急性期炎性反应的关键细胞因子。TNF-α与DPN炎性反应密不可分，在DPN 患者血清中明显升高［10］。TNF-α的激活可引起一系列下游炎性反应的发生，引起神经细胞破坏和脱髓鞘，最终损害周围神经功能。研究发现，miRNA 与炎性反应密切相关［11-13］。

（1）抗炎作用 miR-146a在DM 及DPN患者外周血中的表达均较低，且DPN患者miR-146a表达水平较单纯DM 患者更低，可见，miR-146a表达水平与DPN病情严重程度有关［14-15］。FENG Y H 等［16］研究发现，DPN模型大鼠IL-1β、TNF-α及核因子κB（NF-κB）等细胞因子呈高表达，而miR-146a表达降低。NF-κB是一种促炎转录因子，在miR-146a转录中发挥重要作用。该研究将miR-146a与细胞因子进行Pearson相关分析，结果显示，miR-146a与NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达呈负相关［16］。IL-1受体相关激酶（IRAK1）和TNF受体关联因子6（TRAF6）是Toll样受体（TLR）启动炎症和免疫反应下游途径的重要分子，miR-146a可通过抑制IRAK1和TRAF6的表达，使细胞因子的产生减少。由此认为，在长期高血糖条件下，miR-146a的表达降低，导致其对IRAK1、TRAF6及NF-κB的抑制作用减弱，并使IL-1β和TNF-α表达水平升高，引发DPN炎性反应。LIU X S等［17］使用miR-146a模拟物升高DPN模型小鼠血浆和坐骨神经组织中的miR-146a水平，结果发现，miR-146a治疗可显著提高感觉和运动神经传导速度，降低热刺激阈值，增加周围神经血流灌注、神经纤维数量，促进轴突髓鞘形成，且在DPN 早期阶段就开始采用miR-146a模拟治疗，效果更佳。miR-146a模拟物可能通过其靶基因抑制NF-κB信号激活的炎性反应，从而发挥抗炎作用。

ZHANG Y Z等［18］在DPN模型小鼠中发现miR-25的表达水平降低，TNF-α和IL-1β表达水平升高，而miR-25过表达能显著降低TNF-α和IL-1β的表达，表明miR-25是一种抗炎保护因子。另外，miR-25还可下调Nox4（一种炎症促进因子）和活性氧（ROS）的表达，从而减轻氧化应激引发的细胞损伤，并通过下调晚期糖基化终产物（AGEs）、晚期糖基化终产物受体（RAGE）水平，减少蛋白激酶C-α磷酸化，进而抑制NF-κB的激活，发挥抗炎作用，这表明miR-25可能是DPN的潜在诊断和治疗靶点［18］。

以上研究表明，miRNA 可通过下调炎症细胞因子的表达而抑制炎性反应，外源性miRNA 干预可防止血管神经功能的进一步损害，减轻炎性反应，改善DPN症状，为通过miRNA 临床诊断及治疗DPN 提供了指导。

（2）促炎作用 CHEN J等［19］研究发现，miR-155拮抗剂可减轻周围神经的炎性反应，该结果与此前其他研究一致。miR-155 拮抗剂可降低促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）水平［20］。研究发现，在外周血巨噬细胞中，抑制miR-155可下调TNF-α和IL-1的表达水平［21］。此外，miR-155 抑制剂有助于降低IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白质水平，从而减轻炎性反应［22］。CHEN J等［19］研究发现，miR-155靶向并抑制核因子E2相关因子2（Nrf2）的表达。Nrf2 的缺失会导致NF-κB活性增加，从而产生过多的细胞因子，引发炎性反应［23］。抑制miR-155或恢复Nrf2可促进大鼠雪旺细胞增殖并抑制体外细胞凋亡，减少ROS的产生和减轻炎性反应［19］。由此认为，靶向抑制miR-155-Nrf2治疗可能有助于减少高血糖诱导的氧化应激和凋亡。可见，miRNA抑制剂能有效逆转miRNA 引发的炎症刺激，防治DPN。

2.2 疼痛刺激机制 YANG D等［24］通过建立糖尿病神经性疼痛小鼠模型，证实miR-190a-5p 通过靶向SLC17A6导致糖尿病神经性疼痛，SLC17A6也被称为囊泡谷氨酸转运蛋白2 基因（VGLUT2）。VGLUT2可诱导谷氨酸释放增加，从而导致神经损伤后神经性疼痛的发生［25］。YANG D等［24］研究同时发现，用SLC17A6抑制剂治疗后，糖尿病神经性疼痛模型小鼠腰椎背角IL-1β和IL-6水平下调，小鼠疼痛行为改善。该研究发现，miR-190a-5p 的下调会导致SLC17A6水平升高，增强炎性反应，进而导致疼痛的发生［24］。

LIU W 等［26］研究发现，糖尿病神经性疼痛模型大鼠脊髓背角神经元中miR-9水平上调，且与钙稳态调节剂1（CALHM1）的表达呈正相关。CALHM1是一种新的钙通道，位于神经元膜或内质网。LIU W等［26］发现CALHM1可通过增加神经元中Ca2＋流入和促进ATP的产生诱导嘌呤能P2X7受体（P2X7R）在脊髓背角胶质细胞中的表达，而P2X7可调控神经性疼痛中的ATP 释放和Ca2＋浓度，miR-9 在激活ATP-P2X7R信号通路中的作用与CALHM1相同。另外，miR-9 可下调单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1（MCPIP1），介导小胶质细胞活化，导致促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）上调，引发神经炎症［27］。

WU B等［28］研究发现，糖尿病神经性疼痛模型小鼠miR-193a水平下调，高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达上调，且荧光酶测定结果证实miR-193a直接靶向HMGB1。研究证实，HMGB1在周围神经炎症中发挥炎症介质作用，并参与神经病理性疼痛的发病机制［29］。WU B等［28］给糖尿病神经性疼痛模型小鼠注射miR-193a 模拟物后，逆转了原本过表达的HMGB1水平，表明HMGB1在糖尿病神经性疼痛中的过表达是由miR-193a水平下调引起的。另外，该研究证实HMGB1的过表达能显著上调糖尿病神经性疼痛模型小鼠腰椎背角中炎症细胞因子（如IL-6、IL-1β和TNF-α）水平［28］，这与REN P C等［30］的研究结果吻合；而注射miR-193a模拟物后，炎症细胞因子水平显著降低，说明miR-193a能抑制由HMGB1过表达引起的增强的周围神经炎症。因此，miR-193a可通过抑制HMGB1表达，减轻糖尿病神经性疼痛。

不同miRNA分别通过不同的作用靶点引发或减轻下游炎性反应，引起或拮抗DPN 神经性疼痛，干预miRNA 或其作用靶点，可有效减轻炎性反应，缓解疼痛。

2.3 影响轴突生长 ZHANG X N 等［31］研究发现，DM 晚期模型大鼠的原代分离背根神经节（DRG）神经元中miR-29b表达下调，DRG 神经元细胞凋亡增加，轴突肿胀严重，同时，轴突生成基因被抑制，而神经退行性基因被激活，进行模拟实验恢复miR-29b的表达，结果显示，miR-29b的恢复能促进轴突生成，抑制神经变性，表明miR-29b可保护DRG 神经元免受高血糖的损害。miR-29家族的另一个成员miR-29c也在轴突生长中起重要作用，miR-29c在DPN 模型小鼠DRG 神经元、坐骨神经和足垫组织中表达上调，而PRKCI蛋白呈现与之相反的变化，生物信息学分析、双荧光素酶测定结果显示PRKCI蛋白是miR-29的靶标，体外研究显示，高葡萄糖可分别上调和降低DRG神经元中的miR-29c和PRKCI蛋白水平，这与轴突生长的显著抑制有关，该结果表明在高血糖下miR-29c可通过靶向PRKCI阻断轴突生长［32］。

CHENG C等［33］研究发现，DM 模型小鼠感觉神经元中mmu-let-7i水平下调，mmu-miR-341水平上调，分别使用mmu-let-7i模拟物进行外源性补充和用抗miR 拮抗mmu-miR-341的上调，结果显示，补充mmu-let-7i和敲除mmu-miR-341小鼠的电生理学、结构和行为异常均得到改善，但不改变高血糖状态；另外，暴露于外源性mmu-let-7i模拟物的解离成人感觉神经元生长增强，分支增多，证实mmu-let-7i具有神经营养活性。

DPN的主要病理改变为周围神经脱髓鞘、肿胀，轴突变性，伴有髓鞘再生，雪旺细胞去分化，以上研究表明，miRNA可通过不同靶点促进或抑制轴突生长，改变神经功能，使用保护性miRNA 模拟物或拮抗抑制性miRNA可以促进神经元生长，改善神经功能。

3 miRNA在DPN治疗中的潜在靶点

3.1 外泌体 外泌体是由细胞分泌的直径为50～100 nm 的膜状纳米囊泡，通过转运其内包含的功能性m RNA、miRNA、蛋白质和脂质参与细胞通讯。

间充质基质细胞（MSCs）目前被发现可应用于细胞疗法。间充质干细胞（MSC）主要通过旁分泌效应及分泌血管生成因子、神经营养因子、抗炎分子促进周围神经病变的修复，MSC 来源的外泌体（MSC 外泌体）的治疗效果已在癌症、心脑血管疾病的临床前研究中得到证实，可恢复外周组织的血流。FAN B Y等［34］将MSC外泌体作用于DPN 小鼠，发现MSC外泌体可降低促炎细胞因子水平，并通过将DM 小鼠坐骨神经中的炎性巨噬细胞转化为M2表型以抑制炎性反应；研究同时发现，MSC外泌体包含let-7a、miR-23a和miR-125b等miRNA，并协同靶向TLR4／NF-κB信号通路；此外，MSC外泌体可下调TLR4、IRAK1和磷酸化NF-κB p65的表达。另外有研究证实，MSC外泌体通过抑制TLR信号传导，抑制巨噬细胞活化［35］。FAN B Y 等［34］研究证实，MSC外泌体含有多种miRNA，这些内含的miRNA 可进一步影响炎症通路的激活，减轻DM 小鼠的炎性反应，并促进DPN 小鼠的神经血管重塑和功能恢复。可见，使用MSC 外泌体作为DPN患者的潜在治疗方法具有广泛前景。

雪旺细胞是包裹在周围神经纤维上的神经胶质细胞，能通过分泌神经营养因子促使受损的神经元存活，以及促进轴突的再生以调节周围神经功能。已有研究证实，来自健康雪旺细胞（SC-Exos）的外泌体可显著增强坐骨神经损伤模型大鼠受伤外周轴突的再生［36］。WANG L等［37］对采用SC-Exos治疗的db／db小鼠进行足底试验（热潜伏期）和von Frey试验（机械潜伏期），结果发现db／db小鼠的运动神经传导速度和感觉神经传导速度显著改善；同时发现，采用SC-Exos治疗可使db／db小鼠脱髓鞘和轴突损伤显著减少，髓鞘再生增加。DPN小鼠坐骨神经组织中的许多miRNA（包括miR-21、27a、146a）水平显著降低，而采用SC-Exo治疗后，坐骨神经组织中的miR-21、27a、146a水平显著上升，说明SC-Exo可能通过提高miRNA水平改善周围神经功能［37］。为研究SC-Exos对DRG神经元轴突生长的直接影响，WANG L等［37］进行了体外实验，发现SC-Exos被DRG 轴突内化，并促进糖尿病DRG神经元的神经突生长和雪旺细胞的迁移，说明SC-Exo内含有的miRNA 有助于SC-Exos促进糖尿病DRG神经元中的神经突生长和雪旺细胞迁移。通过该研究推测，SC-Exos可能通过升高保护性miRNA水平，发挥保护和／或逆转受损的周围神经纤维作用。有必要开展更多研究评估SC-Exo治疗能否逆转周围神经纤维损伤，并探索SC-Exo 治疗DPN 的时间窗口。

以上研究证实，多种细胞来源的外泌体可通过抗炎、分泌神经营养因子等途径，使脱髓鞘、轴突损伤减少，轴突再生增加，进而改善周围神经功能，而该作用可能是通过外泌体内含有的多种miRNA 实现的。使用外泌体治疗DPN 可能是有效的，以上研究为临床治疗提供了新思路，但需要更多研究评估其可行性。

3.2 中药复方与单体

（1）糖络宁 LI Y X 等［38］研究糖络宁（黄芪、地黄、当归、狗脊、牛膝、木瓜、续断、丹参）治疗DPN大鼠的miRNA表达谱，分别比较DPN 大鼠和正常大鼠坐骨神经miRNA表达谱，以及接受糖络宁治疗的DPN大鼠和未接受糖络宁治疗的DPN 大鼠的坐骨神经miRNA表达谱，结果发现多个miRNA 水平显著改变（上调或下调），对两个结果分别进行聚类分析，发现基因均可清楚地聚为两类，并在2次分析的差异表达基因中观察到19 个重叠基因，将接受糖络宁治疗的DPN大鼠和正常大鼠的这19个基因进行比较，发现糖络宁可逆转DPN 诱导的这19种miRNA 的变化，表明糖络宁对DPN 的治疗作用可能与miRNA 表达谱的改变有关。该研究通过进一步的通路和基因分析，认为糖络宁可能通过作用于蓬乱蛋白1（DVL1）和神经营养因子-3（NTF3）基因影响Wnt和神经营养因子途径［38］。此外，糖络宁可通过影响定位、细胞质和蛋白质结合过程，改善DPN症状［38］。

张晨等［39］将糖络宁（川牛膝、黄芪、狗脊、全蝎、丹参）作用于大鼠背根神经元，以探究糖络宁是否通过影响miR-211下调凋亡通路以保护背根神经元细胞。该研究以新生大鼠背根神经元细胞作为研究对象，将其分为正常组、高糖组、糖络宁组、miR-211抑制剂阴性组和miR-211抑制剂组，结果显示，与正常组比较，高糖组细胞凋亡率、miR-211 基因表达及蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）、真核翻译起始因子2α（eIF2α）、激活转录因子4（ATF4）、C／EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）蛋白表达水平均较高，而与高糖组比较，糖络宁组和miR-211抑制剂组细胞凋亡率、miR-211 基因表达及PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平均较低，由此认为糖络宁可能通过作用于miR-211下调凋亡通路，保护背根神经元细胞，发挥治疗DPN的作用［39］。

以上两个研究中的糖络宁药物组成不同，但均证实糖络宁可通过作用于miRNA 发挥治疗DPN 的作用，且均从miRNA层面分析中药复方治疗DPN 的机制，为中药复方治疗DPN的有效性提供了依据。

（2）三七 三七皂苷R1是三七的主要生物活性成分之一，现代药理学研究提示，其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用和神经保护特性［40］。WANG W W 等［41］研究三七皂苷R1 对DPN 的作用，通过高糖刺激RSC96细胞建立DPN的细胞模型，在DPN 细胞模型中发现细胞活力受到抑制，高糖可诱导细胞凋亡，当用三七皂苷R1预处理时，发现ROS减少，神经营养因子抑制减弱。另外研究发现，高糖处理上调了miR-503的表达，而三七皂苷R1则显著抑制miR-503的表达［41］。为探究三七皂苷R1细胞保护的机制，WANG W W等［41］重点研究了与DPN发病机制密切相关的两种信号通路（PI3K／AKT 和β-连环蛋白），结果显示，高糖抑制PI3K和AKT磷酸化，并下调β-连环蛋白表达，然而三七皂苷R1预处理可改善高糖诱导的上述蛋白质的改变。当使用miR-503模拟物使miR-503过表达时，三七皂苷R1并没有逆转相应改变［41］。因此该研究证明，三七皂苷R1能通过下调miR-503水平，在高糖水平下激活PI3K／AKT和β-连环蛋白信号传导通路。三七皂苷R1在RSC96细胞中的神经保护和神经营养功能可能是通过其对miR-503表达的调节和激活下游信号传导通路如PI3K／AKT和β-连环蛋白实现的。该研究为DPN的新治疗策略提供了新思路。

中药治疗DPN效如桴鼓，具有对症治疗不可比拟的优越性，越来越多的研究证实中药治疗的有效性。以上研究说明部分中药可能具有调节相关miRNA 水平的作用，通过miRNA 影响下游信号可营养和保护周围神经。

4 小结

现有研究发现，多种miRNA 参与DPN 的发生发展，部分研究使用模拟物补充保护性miRNA 或抑制有害性miRNA，调节靶基因，改善DPN 症状，为DPN的预防和治疗提供了潜在治疗靶点和治疗途径，也丰富了治疗思路，但miRNA 作为治疗DPN 的方法的可能用途还需进一步研究，药物研发及临床疗效验证也需要时间。miRNA参与DPN 发病的机制复杂，且部分miRNA具有多个靶向位点，是否通过调节多种通路参与DPN的发病尚不明确，同时许多miRNA 参与DPN的机制尚未得到阐述，因此仍需要更多的研究进行阐述和证实，为DPN 的预防、诊断、治疗提供新思路。