血清骨钙素及SIRT6在急性缺血性脑卒中的表达及预后价值分析

何德英,潘成德,郭富饶,江思德

急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)是脑卒中最常见类型,近年来其患病率呈逐渐升高的趋势[1]。AIS一旦发生,病情急剧发展,伴随较高的致残率和致死率[2]。寻找能评估AIS病情及预后的生物标志物,对于改善患者预后具有重要意义[3]。骨钙素是由BGLAP基因编码,由非增殖期成骨细胞特异性合成和分泌,参与骨形成、葡萄糖及脂肪代谢的调节[4]。近年来发现,血清骨钙素等骨代谢指标表达失常可增加脑卒中发生的风险,是潜在的AIS血清标志物[5]。去乙酰化酶6(sirtuin 6, SIRT6)具有组蛋白赖氨酸残基的脱乙酰酶作用,参与氧化应激、炎性反应、自噬及衰老等多种生物学过程[6]。研究发现,在急性脑缺血小鼠模型中,SIRT6表达下调能够促进神经细胞凋亡,增加动物病死率,是潜在的AIS血清标志物[7]。本研究通过检测AIS患者血清骨钙素、SIRT6表达,探讨两者对AIS患者临床预后的预测价值,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2019年2月—2021年2月重庆市巴南区人民医院神经内科诊治AIS患者90例为AIS组,男44例,女46例,年龄31～83 (64.35±7.34)岁;体质量指数(BMI)19～27 (22.52 ±2.28) kg/m2,病程1～24(6.12±2.13)h;吸烟史33例,饮酒史40例;既往史:高血压46例,糖尿病18例;头颅MR测量梗死面积:≤4 cm260例、>4 cm230例。以同期诊治的高血压或糖尿病患者90例为非AIS组,男48例,女42例,年龄31～78 (62.97±7.81)岁;BMI 18～29(22.53±2.41) kg/m2;高血压60例,糖尿病30例;吸烟史30例,饮酒史38例。以同期体检健康者90例为健康对照组,男45例,女45例,年龄32～80 (63.82±8.01)岁;BMI 18～28 (22.49 ±2.31) kg/m2。3组受试者性别、年龄、BMI、吸烟史及饮酒史比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究已经获得医院伦理委员会批准(KY20198134075009),受试者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①根据患者临床表现、头颅MR明确诊断为AIS,同时诊断和治疗原则均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》中的相关标准[8];②初次发病;③患者发病到入院时间小于24 h;④无意识障碍及抽搐史;⑤临床资料完整。(2)排除标准: ①既往有AIS病史;②入院予以静脉溶栓、血管内治疗者;③合并颅脑肿瘤、颅脑外伤、严重心律失常、心肌梗死等;④合并骨质疏松、强直性脊柱炎等疾病。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 临床资料收集:包括性别、年龄、BMI、高血压、糖尿病等资料;检测血脂(总胆固醇、三酰甘油、高密度和低密度脂蛋白胆固醇)水平;头颅MR检查并计算脑梗死面积。AIS患者入院时进行美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale,NIHSS)评分[9],评分范围0～42分,评分越高,神经功能缺损程度越重。根据NIHSS评分,分为轻症亚组(0～15分,30例),中症亚组(16～30分,33例)和重症亚组(31～42分,27例)。

1.3.2 血清骨钙素、SIRT6测定:于患者入院次日清晨和健康对照组体检时采取肘静脉血5 ml,室温静置1 h,离心留取上层血清。以ELx800型酶标仪(Biotek公司)检测血清骨钙素(酶联免疫吸附试剂盒购自上海抚生生物公司,货号A102876)、SIRT6水平(酶联免疫吸附试剂盒购自上海沪震生物科技公司,货号HZ-2117)。

1.3.3 随访:患者出院第3个月时均接受门诊复查,应用改良Rankin量表(modified Rankin scale,mRS)评估其预后情况并进行分组[10],预后不良亚组(>2分,n=24),预后良好亚组(≤2分,n=66)。

2 结 果

2.1 3组血清骨钙素、SIRT6水平比较 与健康对照组比较,血清骨钙素、SIRT6水平AIS组均降低(t/P=25.013/<0.001、27.571/<0.001),非AIS组比较差异无统计学意义(t/P=2.559/0.152,3.113/0.067);与非AIS组比较,AIS组2项指标均降低(t/P=31.808/<0.001、36.440/<0.001),见表1。

表1 3组受试者血清骨钙素及SIRT6水平比较

2.2 不同病情严重程度AIS患者血清骨钙素、SIRT6水平比较 血清骨钙素、 SIRT6水平重症亚组<中症亚组<轻症亚组(t/P=7.793/<0.001、3.809/<0.001,10.987/<0.001、6.684/<0.001),见表2。

表2 不同严重程度AIS患者血清骨钙素、SIRT6水平比较

2.3 不同预后AIS患者临床指标比较 与预后良好亚组比较,预后不良亚组梗死面积大、NIHSS评分较高,血清骨钙素及SIRT6均较低(P均<0.01);其他资料2组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 不同预后AIS患者临床指标比较

2.4 AIS患者预后影响的多因素Logistic回归分析 以AIS患者预后为因变量(不良=1,良好=0),以血清骨钙素、SIRT6、梗死面积、NIHSS评分为自变量进行Logistic回归分析,结果显示:梗死面积大、NIHSS评分高是影响AIS患者预后的危险因素,血清骨钙素及SIRT6高是影响AIS患者预后的保护因素(P<0.01),见表4。

表4 AIS患者预后影响的多因素Logistic回归分析

2.5 血清骨钙素、SIRT6水平对AIS患者不良预后的评估价值 绘制血清骨钙素、SIRT6水平对AIS患者不良预后的评估价值ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示: 血清骨钙素、SIRT6及两项联合对AIS 患者不良预后的AUC分别为0.782、0.796、0.886,两项联合的AUC大于各自单独预测效能(Z=4.526、4.209,P均<0.001),见表5、图1。

图1 AIS患者预后的受试者工作特征曲线分析

表5 血清骨钙素、SIRT6水平对AIS患者不良预后的预测价值

3 讨 论

AIS是大脑供血不足导致脑组织损伤的急性疾病,疾病早期可出现神经功能恶化,导致肢体和语言残疾,严重时可导致死亡。目前影响AIS患者病情严重程度及预后的因素较多,如高龄、高血压及糖尿病等[11],但目前尚无有效评估AIS患者预后的血清标志物。研究影响AIS患者预后的因素,有利于指导临床诊治。

骨钙素是由成熟成骨细胞合成分泌的特异性非胶原蛋白,是包含49个氨基酸的小分子肽,不仅参与骨形成、骨转换过程,其还能够作为一种内分泌激素,参与能量代谢及雄性生殖的过程[4]。研究发现,母体骨钙素可以穿过胎盘,促进胎儿大脑神经发生和发育,促进空间学习和记忆能力[12]。本研究中,AIS患者血清骨钙素水平明显降低,提示骨钙素表达下调促进AIS的发生发展。骨钙素不仅表达于成骨细胞,也存在于血管平滑肌细胞中,有学者研究表明血清骨钙素降低能够导致葡萄糖和脂肪代谢紊乱,促进血管钙化、血管动脉粥样硬化、血管内膜增生等的发生,增加AIS等心血管疾病的发生风险[5]。研究表明,骨钙素表达下调增加血管内皮细胞不稳定性,促进动脉血管平滑肌钙化,增加AIS发生的风险[13]。本研究中,AIS患者血清骨钙素与疾病严重程度有关,病情程度越重,血清骨钙素水平越低,提示血清骨钙素水平有助于反映AIS患者疾病严重程度。其原因可能是骨钙素能够促进脑神经细胞代谢重编程,在脑缺血时发挥保护作用。实验研究表明,骨钙素的表达下调能够激活脯氨酸羟化酶1,促进缺氧诱导因子1α的表达及葡萄糖的有氧氧化,加重脑缺血缺氧时神经元的损伤[14]。此外,骨钙素水平降低还能降低循环内皮祖细胞的水平,降低其增殖和分化为血管内皮细胞的能力,缺血区新生血管生成减少,加重AIS神经损伤的严重程度[13]。本研究结果表明,骨钙素高表达是影响AIS预后的保护因素。分析其原因,可能是骨钙素能够通过抑制AIS缺血半影区神经元的死亡,发挥神经保护作用。研究表明,骨钙素能够通过抑制缺血半影区神经元中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活性及Gasdermin D的表达,进而抑制神经细胞焦亡的发生,减少神经细胞的死亡及患者神经功能障碍的发生[15]。

sirtuin家族包括SIRT1～SIRT7共7个成员,具有去乙酰酶和ADP核糖转移酶活性[16]。SIRT6主要位于细胞核中,是一种多功能表观遗传酶。近年研究发现,SIRT6表达降低能够诱导血管内皮细胞衰老,抑制内皮细胞增殖及血管舒张,参与动脉粥样硬化等的发生发展[17]。本研究结果表明,AIS患者血清SIRT6水平明显降低,提示SIRT6表达下调促进AIS的疾病发生。有学者证实,在原代人脑微血管内皮细胞中,缺氧条件能显著抑制SIRT6的表达,并在大脑中动脉闭塞的小鼠脑组织中观察到SIRT6表达下调的现象[18]。有研究报道,内皮细胞SIRT6特异性敲除的AIS小鼠中,脑微血管内皮细胞凋亡显著增加,引起血脑屏障功能障碍,同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的过度激活促进神经元凋亡,加重动物神经功能损伤,增加动物病死率[7]。细胞实验也证实,缺氧/复氧损伤降低了原代人脑微血管内皮细胞中SIRT6的表达水平,损害血管内皮细胞的屏障功能,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表达增加,神经元存活途径Akt通路受到抑制,加重AIS病情程度[7,19-20]。本研究中,血清SIRT6高表达是影响AIS患者不良预后的独立保护因素。有学者发现,脑神经元中SIRT6的过度表达能够上调核因子E2相关因子2的表达,增强机体抗氧化能力,减轻了缺血再灌注损伤时氧化应激诱导的脑组织损伤和神经功能缺损,而敲除核因子E2相关因子2的表达后,SIRT6则失去神经保护作用[21]。尚有学者发现,SIRT6能够促进海马中小胶质细胞由M1型向M2型极化,抑制神经元的氧化应激损伤,改善手术引起的认知功能障碍[22]。因此,AIS中SIRT6的表达下调参与AIS疾病的发生发展,是评估AIS患者预后的血清标志物。

综上所述,AIS 患者血清骨钙素、SIRT6表达降低,两者的表达与AIS患者病情严重程度有关,是影响AIS患者不良预后的独立因素。临床医师可根据AIS患者血清骨钙素及SIRT6水平,对不同预后AIS患者进行风险分层,优化不良预后的AIS患者的临床治疗方案,以减轻患者神经功能损伤程度,改善患者临床预后。此外,针对骨钙素、SIRT6的临床治疗药物能否有效治疗AIS,改善AIS患者预后,值得今后进行深入研究。本研究为单中心研究,尚可能存在潜在影响血清骨钙素、SIRT6水平的其他疾病,有待今后设计多中心大样本临床试验,排除可能的混杂因素进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

何德英、郭富饶:提出研究思路,设计研究方案,实施研究过程,分析试验数据,论文撰写;潘成德:实施研究过程,资料搜集整理,论文撰写;江思德:课题设计,进行统计学分析