基于网络药理学和分子对接法研究参七解郁方治疗双心疾病的分子机制

刘莉，王凤荣

作者单位：1辽宁中医药大学研究生学院，辽宁 沈阳 110847；

2大连大学附属中山医院老年病科，辽宁 大连 116001；

3辽宁中医药大学附属医院心内科，辽宁 沈阳110032

双心疾病是心血管系统疾病与精神情绪障碍并存的一类疾病，目前常指冠心病合并焦虑抑郁状态，越来越多的临床资料显示冠心病病人常同时合并焦虑抑郁状态。冠心病与焦虑抑郁相互作用、相互影响，互为因果，会导致疾病进一步恶化。冠心病人群患有焦虑抑郁的发生率明显高于普通人群［1-2］，这既增加了病人的病痛与经济负担，也占用了社会医疗资源，因此对于双心疾病的防治已经成为我国心血管疾病领域亟需解决的重要公共卫生问题［3］。

中医经典理论认为心在人体中处于最高主导地位，心主血脉，心藏神，指心既是血液循环的原动力，又是精神、意识和思维活动的中心。《素问·五脏生成论》：“诸血者皆属于心。”《素问·六节藏象论》：“心者，生之本，神之变也。”《素问·灵兰秘典论》：“心者，君主之官，神明出焉。”由此，可以看出心主神明的重要生理功能。相反，心主神明功能一旦失司，就会导致情志异常，发展为郁病。因此，双心理论也是中医心系疾病理论的重要反应，既体现在生理方面相互依存，又体现在病理方面互为因果。目前，双心疾病的治疗通常是在冠心病治疗的基础上再加用抗焦虑抑郁药，而长期应用这类药物会使病人产生很强的依赖性，而且还加重了病人的经济负担［4］，而中医药对于双心疾病的治疗效果确切，安全性也能得到很好保证，在近十年的发展过程中逐渐受到关注与认可［5］。

王凤荣教授在古文“开心散”“定志小丸”的基础上创立了参七解郁方，由远志、石菖蒲、人参、丹参、三七、郁金、合欢、柴胡、香附、百合、珍珠母、炙甘草组成；其功效为益气化痰、安神定志，参七解郁方在临床治疗双心疾病中获得较好的疗效，尤其对PCI术后双心疾病的干预方面疗效可靠。

网络药理学是多学科融合形成的新兴技术，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，主要通过各种组学数据分析和计算机模拟手段构建多层次网络来实现。分子对接是一种研究小分子配体与蛋白质受体之间相互作用和识别的理论方法。本研究将网络药理学和分子对接技术相结合共同研究中药参七解郁方治疗双心疾病，为活性成分筛选和机制探索提供新的方法［6］。

1 方法

1.1 数据库与软件本研究主要应用的生物信息学工具包括：中药系统药理分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/）、TCMID 数 据 库（http：//www.megabionet.org/ tcmid/）、Gene Cards 数据库（https：//www.Genecards.org/）、在线韦恩分析工具（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/Venn/）、Uniprot 网站（https：//www.uniprot.org）、Pubchem 数据库（https：// pubchem. ncbi. nlm.nih.gov/）、Gene Cards 数据库（https：//www.genecards.org/）、String 数据库（https：//cn.string-db.org/）、DAVID 网站（https：//david.ncifcrf.gov/）、Auto Dock Tools 1.5.7软件。

1.2 参七解郁方中化学成分以及其可能靶点预测利用TCMSP 平台为主查找参七解郁方的药物化学成分，筛选条件设定为：（1）类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，（2）口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%， TCMSP 平台检索不到的成分通过TCMID 平台为补充进行查找。Uniprot 网站确定各靶点的Uniprot ID。每个化合物利用 Pubchem 获取 SMILES 和3D 文件，以便进行化合物的靶点预测和分子对接的应用操作。

1.3 双心疾病靶点收集利用Gene Cards 数据库，以“ coronary heart disease”“ anxiety- depression”为关键词检索得到双心疾病的相关靶点及基因。

1.4 参七解郁方治疗双心疾病靶点筛选在韦恩分析工具在线网站输入参七解郁方的药物组成化合物以及双心疾病可能的有关基因，获取其交集以得到共同作用靶点。

1.5 蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建以及核心靶点筛选将药物成分化合物与疾病的交靶点输入到String 数据库，构建PPI网络。将PPI网络数据导入EXCEL 表格，通过Cytoscape 3.9.0 软件对构建的PPI网络进行可视化处理。

1.6 基因富集分析基因本体（gene ontology，GO）功能主要分为三大类，即细胞组成（cellular component，CC）、生物学过程（biological process，BP），以及分子功能（molecular function，MF）。京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能的数据库。KEGG 通路富集分析常常应用于差异表达基因的功能注释，了解差异表达基因的相关功能与作用通路［7］。

在DAVID 网站输入参七解郁方中活性成分与双心疾病的共同潜在靶点，在KEGG富集信号通路，并且将基因本体GO 功能进行富集分析。GO 富集分析时设定筛选阈值P＜0.05，分析细胞组成、生物学过程，以及分子功能，将每组的前10 位排名绘制成柱状图，进行可视化操作。通过制作气泡图对排名位于前30的信号通路进行可视化分析。

1.7 运用分子对接技术验证参七解郁方活性成分与双心疾病的潜在靶点选择PPI网络图中的主要活性化合物与作用靶点进行分子对接验证。从Pub Chem 分别获得靶点蛋白以及化合物的三维立体结构，采用Auto Dock工具对蛋白受体和配体进行常规处理后，进行分子对接，得到结合能， 即成分与靶点的结合能是评价分子对接结果的重要依据，结合能越低结合就越稳定，靶点与分子作用的可能性就越大。

2 结果

2.1 参七解郁方化合物、潜在靶点以及疾病靶点预测结果TCMSP 检索到参七解郁方中289 个化合物，TCMID 检索到参七解郁方中16 个化合物，总计305 个。其中没有预测到靶点为合欢花中有3 个化学成分与珍珠母中有9 个化学成分。Gen Cards 数据库中检索到冠心病靶点1 924 个，焦虑抑郁靶点1 279个。通过韦恩在线工具分析参七解郁方、冠心病、焦虑抑郁的可能靶点，获得共有交集92个靶点，得到参七解郁方治疗双心疾病的潜在共有靶点。韦恩图见图1。

图1 参七解郁方与双心疾病靶点的韦恩图

2.2 参七解郁方治疗双心疾病共有靶点的PPI 网络结果由图2 可知，将参七解郁方治疗双心疾病的交集靶点导入STRING 平台，绘制PPI网络图。将置信度得分设置为0.7，除MT-ND6、DYRK1A、KCNMA1、CHRM2、CLDN4 等蛋白与其他蛋白之间没有形成互作关系被排除，该网络包含80 个节点及240条边，平均度值（degree）为6，平均局部聚类系数为0.453，P＜1.0×10-16，提示与随机相似靶点对比，此组相互作用靶点的差异有统计学意义。评价参数设定为节点度值，在PPI网络内，随着其靶点度值的增加，发挥的生物学作用可能更大。该网络节点的大小与度值成正比，而且度值由小到大亦决定网络节点颜色由浅到深。

图2 参七解郁方治疗双心疾病靶点的PPI网络图

如图3 所示，靶点度值排名前10 位的依次为信号转导和转录活化因子（STAT3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤蛋白p53 基因（TP53）、c-fos 原癌基因蛋白（FOS）、雌激素受体α（ESR1）、白细胞介素-4（IL-4），提示这些靶点是参七解郁方发挥治疗作用的潜在关键靶点。

图3 参七解郁方治疗双心疾病关键靶点信息

2.3 GO 生物功能注释及 KEGG 通路富集将80个靶点输入DAVID 网站进行富集，进行GO 功能富集分析，每组筛选条件设定为P＜0.05，得到细胞组成相关条目34 条，生物过程相关条目335 条，分子功能相关条目48 条，每组选取排名前10 位的条目进行可视化。

将参七解郁方干预双心疾病的靶点导入David在线工具富集KEGG通路，获得条目106条，其中P＜0.05 的条目100 条，去除与双心疾病明显无关通路，如疟疾、肺结核、阿米巴病、弓形虫病、类风湿性关节炎、利什曼病、百日咳等，选取P＜0.05 且与双心疾病相关的前30条绘制成气泡图，见图4。

图4 参七解郁方治疗双心疾病靶点KEGG信号通路分析

80 个基因中有67 个基因参与了前30 条通路的富集，涉及的信号通路包括低氧诱导因子-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、磷脂酰肌醇3 激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶信号通路（PI3K-AKT signaling pathway）、T 细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway、叉头框转录因子O 亚族信号通路（FoxO signaling pathway）、丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）等通路，提示参七解郁方对于双心疾病的治疗可能通过多条信号通路以及作用多个作用靶点起作用。

2.4 药物化合物-潜在靶点-信号通路网络构建选择KEGG 富集中的与双心疾病相关的前30 条通路所包含的靶点以及靶点所对应的化合物构建化合物-靶点-通路网络，见图5。此网络包含了节点175个，边线535 条，以度值为标准，参七解郁方活性化合物节点度值的中位数为4，涉及的活性成分有89个，如表1 所示，主要在前30 条信号通路中发挥作用，可能通过作用于56个靶点。

图5 参七解郁方治疗双心疾病的成分-靶点-通路网络

表1 参七解郁方的活性成分信息

参七解郁方中度值大于5 的化合物共12 个，分别为槲皮素、木樨草素、山柰酚、柑橘素、二氢丹参内酯、丹参酮ⅡA、丹参新醌D、异丹参酮Ⅱ、异鼠李素、3'，5'-二甲氧基联苯-4-醇、隐丹参酮、β 谷甾醇，表明参七解郁方可能通过多成分、多靶点、多通路治疗双心疾病。

2.5 分子对接结果将度值大于5的前7 个活性成分的分子配体与前5个靶点STAT3、AKT1、IL-6、TNF、MAPK1 进行对接，表2为对接靶点与活性成分的结合能数据，活性成分与靶点的分子对接显示对接能力均较好。参七解郁方活性成分与靶点的分子对接模式图见图6。

图6 参七解郁方活性成分与靶点的分子对接模式图:A为STAT3与木犀草素结合；B为AKT1与丹参酮ⅡA结合；C为IL6与异丹参酮Ⅱ结合；D为TNF与山柰酚结合；E为TNF与柑橘素结合；F为MAPK1与异丹参酮Ⅱ结合

表2 活性成分与靶点的分子对接结果

3 讨论

胡大一教授在我国最早提出“双心医学”理论，指心血管疾病可导致精神情绪障碍，相反精神情绪障碍又会加重原发疾病，疾病之间相互作用，导致疾病加重，病人痛苦不堪，有循证医学研究表明也证实了这个结果［8］。冠心病中医学归为“胸痹”“心痛”“真心痛”等，“焦虑抑郁”归为“郁证”，两者虽然分属不同疾病，但病位均为心，并与肝、脾、肾三脏均有密切联系。如《灵枢》所云：“悲哀愁忧则心动，心动则五脏六腑皆摇”［9］。王凤荣教授以《千金方》的“开心散”“定志小丸”化裁［10］，独创参七解郁方，益气化痰、安神定志。其中远志、石菖蒲具有开窍化痰之功，与补气安神之人参共用，合为君药。正如《本草经》中所说此三药共用有益气养阴，定志解郁之功效。

网络药理学研究主要包括三个部分，一为筛选药物活动化学成分，二为获取潜在的作用靶点，三为建构作用网络，比较适合于中药复方多靶点、多途径作用特点的机制研究。分子对接技术从刚性对接、半柔性对接到柔性对接，逐步阐明配体与受体的结合是一个动态过程，即配体与受体诱导契合过程中发生构象改变，最终形成形状和能量最优匹配的结合模式［11］。

本研究运用网络药理学研究方法得到参七解郁方核心药物组合发挥作用的主要有效成分，可分为黄酮类化合物和丹参类化合物，其中黄酮类化合物包括黄酮（柑橘素和木樨草素）、黄酮醇（槲皮素、山柰酚）、类黄酮（异鼠李素），丹参类化合物包括丹参酮类（异丹参酮Ⅱ、丹参酮ⅡA、丹参新醌D、二氢丹参内酯、隐丹参酮）和丹参酚类（β 谷甾醇）。黄酮对心脑血管有很好的保护作用，其可使体内的胆固醇降低，使机体的血液循环得到改善，而且黄酮还有很强用抗氧化作用，通过清除氧自由基而起作用，从而阻止了细胞老化，可使心脑血管疾病的发病率有效降低［12］。有研究发现，一些具有抗焦虑抑郁的中药中有很多含有黄酮类化合物成分［13］。槲皮素可通过多种途径治疗焦虑抑郁等神经系统疾病，主要途径包括降低炎症因子、调节神经突触可塑性等［14］。有研究表明中枢神经系统炎症因子水平升高是抑郁症的重要表现之一，而槲皮素可以通过降低大脑内的炎症因子以预防小鼠的抑郁样行为［15］。山柰酚亦有抗抑郁的治疗效果，主要通过提升海马神经营养因子的水平、抑制神经细胞过度自噬等途径发挥作用［16］。木犀草素能够使细胞凋亡水平降低并使细胞活力得到增强，其主要通过抑制MMP9及使PI3K/AKT 信号通路激活而实现的［17］，从而达到抑制凋亡、抗炎、改善动脉粥样硬化等作用。丹参作为经典的传统中草药，具有祛瘀止痛、活血通经的作用，而且还具有清心除烦的疗效，在双心疾病的治疗方面效果可靠［18-19］。丹参类化合物包括多种有效成分，其中丹参酮类成分含量较高，其有扩张血管、降脂、抗氧化等作用。学者研究表明动脉硬化大鼠血清中水平较高的ox-LDL、MDA、ROS可以通过丹参酮类化合物干预降低，SOD 水平得到提高。临床研究表明氧化应激会导致机体的氧自由基水平升高，而这也是引发焦虑抑郁状态的精神类疾病的重要病因之一。有研究表明应用隐丹参酮干预抑郁模型小鼠，其可使小鼠前额叶皮质与海马的BDNF 的表达水平得到提升，提示隐丹参酮发挥抗抑郁作用可能通过改善BDNF得到体现［20］。

PPI 网络以及核心靶点显示参七解郁方的有效成分靶点主要为 STAT3、AKT1、IL6、TNF、MAPK1等，且分子对接证实有效成分靶点与各主要成分之间具有良好的结合能力。STAT3作为调节细胞因子诱导的促炎和抗炎反应的重要转录因子之一，可促进与炎症相关的基因表达，其激活可增加神经炎症相关的细胞因子分泌［21］。MAPK 信号传导涉及多种生物过程，如组织发育、细胞增殖、细胞凋亡等等。在动脉粥样硬化形成过程中，ox-LDL 和酶促修饰LDL 在巨噬细胞中诱导MAPK 活化，这反过来通过PPAR 介导的LDL 摄取受体如CD36 的上调来增强LDL 摄取［22-23］。此外，MAPK1 可通过调节转录、翻译、细胞骨架重排来介导多种生物学功能，可参与神经发育、神经可塑性和重度抑郁症的基因。KEGG 通路富集结果发现，参七解郁方可能通过调节PI3K-AKT 信号通路、FoxO 信号通路、MAPK 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路等改善双心疾病。PI3K/AKT 信号通路为重要的细胞信号通路之一，其广泛存在于细胞中，是介导多种生长因子促存活的重要通路，在抑郁症及抗抑郁药物作用机制的研究中逐渐受到关注。AKT 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为 PI3K下游的一个重要靶标。AKT有AKT1、AKT2、AKT3。AKT1 是3 种亚型中为最重要的亚型，也是唯一在心脏和大脑中都富集的AKT 亚型，在冠心病及焦虑抑郁中均发挥重要的作用［24］。Fox O 家族是Fox基因家族中的一个亚族，能与DNA上的反应元件结合，激活靶基因，参与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等过程。PI3K/AKT 信号通路在Fox O调节过程中发挥着重要的作用。

从网络药理学分析结果可见，参七解郁方治疗双心疾病为多成分、多靶点、多通路的模式。参七解郁方可能通过活性成分槲皮素、木樨草素、山柰酚、柑橘素、丹参酮ⅡA、丹参新醌D、异丹参酮Ⅱ、异鼠李素、3'，5'-二甲氧基联苯-4-醇、隐丹参酮、二氢丹参内酯、β 谷甾醇等与 STAT3、AKT1、IL-6、TNF、MAPK1 等蛋白结合，进而调节TNF signaling pathway、PI3K-AKT signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、MAPK signaling pathway 等信号通路，发挥降低炎症反应、凋亡，提高神经营养、可塑性等的作用。

本研究通过网络药理学方法和分子对接技术对参七解郁方治疗双心疾病的作用靶点和途径进行预测和验证，研究的局限性也很明确，即未采用体内、外实验来验证预测的结果，仅仅使用分子对接验证方式仍是不够深入的，还需进行具体实验进一步论证与探索，这为我们今后的研究提供了新思路和新方向。