基于Rho/Rock通路研究麝香心痛宁抗大鼠血管损伤后内膜增生的机制研究

于凌群,高伟萍,史明仟,辛新,王萌媛,曹桂云,杨莹

(1.山东中医药大学,山东 济南 250355;2.山东宏济堂制药集团股份有限公司,山东 济南 250103)

目前,心脑血管疾病发病率、致死率均居疾病首位,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病发病最重要的一个病理生理基础[1]。对于存在血管狭窄等严重威胁生命的AS患者,临床治疗手段包括血管成形术、支架植入、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)等。PCI是目前非常有效的治疗手段,但手术过程损伤血管,极易导致术后血管内膜增生,引起继发性的血管再狭窄及支架内血栓形成等问题。腹主动脉球囊损伤术所导致的血管内皮剥落和平滑肌细胞增生,与人类PCI术所引起冠脉狭窄的病理变化过程相似,可模拟人类PCI术血管内膜增生病变过程[2]。

研究表明,Rho/Rock信号通路在血管损伤后内膜增生的发生过程中有着重要的作用。AS发生过程中,血管Rock表达异常升高,可促进激活NF-κB通路,导致炎症因子的积聚,进而引起血管损伤后新生内膜的增生[3]。抑制Rho/Rock信号通路可起到保护血管内皮的作用,维持血管稳态。Rho/Rock信号通路在增强胆固醇摄取和泡沫细胞形成中也发挥了重要的作用[4]。麝香心痛宁由延胡索、川芎、人参、麝香、苏合香、冰片六味中药组成,具有行气开窍、活血化瘀、通络止痛之功效,用于治疗胸痹,冠心病气滞血瘀证者[5]。麝香心痛宁能否抑制血管损伤后内膜增生还未见报道,本研究建立腹主动脉球囊损伤大鼠模型观察麝香心痛宁的药理作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物取健康成年雄性SD大鼠30只,体重260～280 g,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供,实验动物使用许可证号:SCXK(鲁)2022 0006,实验动物伦理号:SDUTCM20201030002,饲养条件:温度为(23±1)℃,相对湿度为60%～70%,光/暗周期为12 h。

1.2 试剂与仪器麝香心痛宁(山东宏济堂药业集团有限公司);BCA蛋白定量试剂盒(山东思科捷生物技术有限公司);PAGE凝胶快速制备试剂盒10%(上海雅酶生物医药科技有限公司);显影液、TBST(上海碧云天生物技术有限公司);电泳液、转膜液、PBS(Biosharp公司);抗体(Abcam公司)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中山金桥生物科技有限公司);4%多聚甲醛缓冲液(Biosharp公司);酶联免疫吸附试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司);化学试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

正置光学显微镜(Nikon 公司); 酶标仪(德国Thermo Scientific 公司);GE Amersham Imager 600多色荧光成像系统(GE Healthcare公司);LightCycler 480II 实时荧光定量 PCR仪(Roche公司)。

1.3 模型制备及分组给药取健康成年SD大鼠30只,随机分为假手术组、模型对照组、麝香心痛宁(200 mg·kg-1)组。大鼠术前禁食不禁水12 h后称重,腹腔注射3%的戊巴比妥,麻醉后于颈部正中做切口进行手术操作。正中纵向做3 cm左右切口,钝性分离皮下组织。模型对照组及麝香心痛宁组,分离大鼠的左侧颈动脉,并用外科缝合线将其颈总动脉血管远心端结扎,用眼科剪在血管近心端剪开一个V形创口,将浸润过酒精、肝素的球囊(2.00 mm × 12.00 mm)从V形创口送至腹主动脉(送入深度约8 cm)。将5 mL注射器注入肝素充盈球囊并回拉旋转球囊导管至左颈总动脉处,将球囊抽至负压再送入血管,反复缓慢牵拉球囊3次。确保血管损伤后,拉出球囊,结扎颈动脉,清洗手术创口后缝合。假手术组只进行左侧颈总动脉血管的分离,用外科手术缝合线结扎,并不用球囊进行血管内部损伤。麝香心痛宁组大鼠灌胃给予200 mg·kg-1的药物,10 mL·kg-1,每天1次,连续14 d。模型对照组和假手术组同法给予等容积的生理盐水。大鼠于末次给药12 h 后,处死,下腔静脉取血,分离腹主动脉,取两厘米长腹主动脉置于4%多聚甲醛溶液,剩余血管及器官组织置于-80 ℃ 冰箱保存。

1.4 指标检测

1.4.1 大鼠血管组织HE染色大鼠腹主动脉血管组织石蜡包埋、切片后进行HE染色,随后置于光学显微镜下观察组织病理变化。

1.4.2 大鼠血清SOD、MDA、MCP-1及GSH-Px含量检测用化学试剂盒测定血清氧化相关标记物SOD、MDA、MCP-1、GSH-Px含量。

1.4.3 ELISA法检测大鼠血管组织NO、ET-1、VEGF和IL-1β的含量采用双抗体夹板法测定血管组织相关因子的浓度。

1.4.4 实时荧光定量PCR取存于-80 ℃冰箱的血管组织,Trizol抽提总RNA,按逆转录试剂盒说明书以总RNA为模板,逆转录cDNA,按SYBR Green PCR 试剂盒,以β-actin为内参,检测大鼠血管组织中相关因子的mRNA水平。

1.4.5 Western blotting取大鼠血管,PBS漂洗后剪成小块加入蛋白裂解液,冰浴后匀浆器匀浆,4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min,取上清液,使用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。制胶,电泳,转膜,将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h,加入一抗4 ℃孵育过夜。用TBST洗5遍5 min后加入山羊抗兔IgG,室温孵育30 min;加入显影液,观察条带并拍照。

2 结果

2.1 麝香心痛宁对主动脉血管内膜损伤的影响假手术组大鼠腹主动脉血管内膜结构基本正常。模型对照组大鼠腹主动脉血管部分部位弹力变弱且管壁增厚,内膜血管平滑肌细胞增多,中膜血管平滑肌细胞排列紊乱,血管管腔呈向心或偏心性狭窄。麝香心痛宁组大鼠腹主动脉血管内皮剥脱,内膜增生等病理现象均有改善(见图1)。

图1 麝香心痛宁(SXN)对主动脉血管内膜的影响

2.2 麝香心痛宁对大鼠体重的影响与模型对照组相比较,麝香心痛宁给药1、2周后大鼠体重无统计学差异。

2.3 麝香心痛宁对大鼠血清相关指标的影响与假手术组相比,模型对照组大鼠血清中SOD和GSH-Px下降,而MDA和MCP-1增加(P<0.05)。与模型对照组相比,麝香心痛宁可增加SOD和GSH-Px的含量,而降低MDA和MCP-1的含量(P<0.05),差别有统计学意义。

2.4 麝香心痛宁对大鼠血管组织相关指标的影响与假手术组相比,模型对照组大鼠腹主动脉血管组织NO含量下降,而ET-1、VEGF 及IL-1β增加(P<0.05)。与模型对照组相比,麝香心痛宁可增加NO的含量,而降低ET-1、VEGF 及IL-1β的含量(P<0.05),差别有统计学意义。

2.5 麝香心痛宁对大鼠血管组织Rho/ROCK通路相关因子mRNA和蛋白表达的影响与假手术组相比,模型对照组大鼠腹主动脉血管组织Rock1、Rock2和Rho的mRNA和蛋白水平均升高(P<0.05)。与模型对照组相比,麝香心痛宁可降低Rock1、Rock2和Rho的mRNA和蛋白的表达(P<0.05),差别有统计学意义(见图2)

A.qPCR法检测Rock1、Rock2和Rho mRNA的表达;B～C.WB法检测Rock1、Rock2和Rho蛋白的表达

3 讨论

PCI术和冠状动脉搭桥等都是治疗冠心病的主要手段,而术后支架内再狭窄也是导致心血管事件发生率升高的主要因素。血管内膜炎性细胞浸润、内皮细胞增生、血管平滑肌(VSMC)迁移至内膜等导致内膜增厚,是管腔狭窄的主导因素,因而如何抑制血管内膜增厚、防止血管发生再狭窄是心血管疾病的研究热点之一[6]。目前临床上用于PCI 术的药物主要有雷帕霉素、紫杉醇等。此类药物阻止损伤部位血管平滑肌增殖迁移的同时,也会干预损伤血管内皮化,这就会引起血管迟发性再狭窄以及迟发性血栓的生成,导致PCI术后心血管不良事件的发生。因此寻找安全有效的治疗血管再狭窄药物,具有重要的临床研究意义。

研究发现[7]大鼠球囊损伤后24 h可引起VSMC增殖、迁移,14 d后内膜增生达到最高峰;21 d模型对照组内膜呈进行性弥漫性增厚,其中以平滑肌为主,中膜细胞排列紊乱,管腔面积明显缩小。本研究建立大鼠腹主动脉球囊损伤术模型发现,假手术组管壁结构完整,血管内膜呈现良好的连续性,中膜边缘可见VSMCs规则排列。模型对照组大鼠与假手术组相比,大鼠主动脉血管内皮剥落,内膜明显增厚,血管腔变窄。麝香心痛宁组大鼠腹主动脉内皮剥脱、内膜增厚、血管平滑肌迁移等病理现象减少,表明麝香心痛宁可抑制腹主动脉球囊损伤大鼠血管内膜增生。

NO、ET-1和VEGF是反映血管内皮功能的因子,NO具有舒张血管平滑肌,抑制炎症因子和血小板黏附于血管的作用,ET-1 可促进血管平滑肌细胞增殖,并收缩血管,VEGF可促进内皮细胞的迁移和增殖[8]。麝香心痛宁可调节血管内皮相关因子的含量[9],从而抑制内膜增生的发展进程。通过检测大鼠血管炎症相关因子IL-1β表达发现麝香心痛宁可降低IL-1β表达。此外,麝香心痛宁可抑制Rho/Rock通路相关因子的表达。综上所述,麝香心痛宁具有保护血管内膜、抑制内膜增生的作用,并具有抗氧化损伤和抗炎作用。麝香心痛宁抑制血管损伤后内膜增生的药理作用机制可能与其抑制Rho/Rock信号通路相关。