五子衍宗丸的药效挖掘及斑马鱼实验验证

赵晨,杨怡雯,王洪平,彭平,尹琼,肖婷婷,徐懿乔

(1.北京同仁堂股份有限公司科学研究所,北京 100079;2.杭州环特生物科技股份有限公司,浙江 杭州 310051)

五子衍宗丸由枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子组成[1],为中医补肾固精助肾阳的经典方。五子衍宗丸本为补肾填精所设,在中医辨证论治观与“异病同治”思想的指导下,凡是肾虚精亏之证均可采用五子衍宗丸治疗[2]。

斑马鱼既具有细胞等体外实验用药量少、实验费用低、周期短、高通量等特点,又具备整体动物实验可观察多个器官、评价药效学、药动学以及可评价代谢物活性等优势[3]。目前基于已知疾病机制而建立的斑马鱼模型在生物医学的诸多领域快速发展,也应用于心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病、视网膜疾病、感染性疾病、骨质疏松等诸多临床常见病,并在抗癌、抗血栓与止血等领域得到应用[4]。本研究应用计算二次开发的方法和生物验证相结合,研究药物与疾病的关联并利用斑马鱼模型加以验证,挖掘五子衍宗丸潜在的适应证。

1 材料与方法

1.1 仪器AZ100电动聚焦连续变倍荧光显微镜(Nikon公司);ACCU-CHEK Performa血糖仪(罗氏诊断产品有限公司);TG16G高速离心机(上海依赫生物科技有限公司);Zebra Lab 3.11行为分析仪(ViewPoint公司)。

1.2 试剂与试药五子衍宗丸(同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂);盐酸吡格列酮片(江苏德源药业股份有限公司);磷酸西格列汀片(Merck Sharp &Dohme Italia SPA);纯蛋黄粉(浙江艾格生物科技股份有限公司);血糖仪试纸(罗氏诊断产品有限公司);葡萄糖、结晶氯化锂、甲基纤维素、六水氯化铝均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙酰胆碱酯酶检测试剂盒(AAT Bioquest公司)。

1.3 动物斑马鱼均饲养于28 ℃的养鱼用水中(水质:每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐,电导率为450～550 μS·cm-1;pH为6.5～8.5)。野生型AB品系斑马鱼、转基因运动神经元绿色荧光NBT品系斑马鱼、转基因中性粒细胞荧光斑马鱼品系与外周运动神经绿色荧光斑马鱼杂交品系斑马鱼,各品系斑马鱼以自然成对交配方式进行繁殖。

1.4 五子衍宗丸药效作用挖掘

1.4.1 五子衍宗丸化学成分及靶点的收集借助BATMAN-TCM平台(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),筛选条件为Score cutoff≥20,P-value cutoff<0.05,收集枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子的成分及靶点。

1.4.2 靶点的组织特异性将相关靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),使用作用部位分析功能,富集靶点作用的组织[5]。

1.4.3 药物-疾病通路关联分析使用DAVID平台的GAD_DISEASE子库、R:enrichDGN包进行疾病富集分析,选择P值小于0.01极其显著富集的疾病作为分析的目标。选择前10种疾病进行通路谱关联性分析,为了获得可信度较高的数据,使用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)平台检索疾病并获得靶点,取两个平台的并集作为疾病靶点,使用R语言对靶点进行KEGG通路富集。使用R语言对五子衍宗丸的靶点进行KEGG通路富集。选取富集的P值不大于0.01的通路计算药物-疾病的关联性[6]。

1.5 斑马鱼的药效验证

1.5.1 防治阿尔茨海默病药效试验

1.5.1.1 模型的制备、分组与给药采用水溶给予六水氯化铝建立斑马鱼阿尔兹海默病模型。随机分为正常组、模型对照组、阳性对照组和五子衍宗丸组,每组30尾,给药组分别水溶暴露给予相应受试药物。阳性药为盐酸多奈哌齐(3.33 μg·mL-1)。

1.5.1.2 反应能力恢复以及运动功能障碍恢复评价随机选取4 dpf野生型AB品系斑马鱼,28 ℃处理24 h后,每个实验组随机选取10尾斑马鱼,以光暗刺激下斑马鱼的每分钟平均运动速度的统计学分析结果评价五子衍宗丸反应能力恢复作用,以斑马鱼的运动距离的统计学分析结果评价五子衍宗丸运动功能障碍恢复作用。

1.5.1.3 乙酰胆碱酯酶抑制作用随机选取4 dpf野生型AB品系斑马鱼,28 ℃处理48 h后,采用乙酰胆碱酯酶测定试剂盒,利用多功能酶标仪采集数据,以斑马鱼体内乙酰胆碱酯酶荧光值的统计学分析结果评价样品对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。

1.5.2 降糖药效试验

1.5.2.1 模型的制备、分组与给药采用白天给予1.5 mg·mL-1的水溶蛋黄粉溶液,晚上给予30 mg·mL-1的水溶葡萄糖溶液,建立斑马鱼高血糖模型。随机分为正常组、模型对照组、阳性对照组和五子衍宗丸组,每组30尾,给药组分别水溶暴露给予相应受试药物。血糖水平评价的阳性药为盐酸吡格列酮(20.0 μg·mL-1),周围神经保护功效及周围神经炎症消退功效评价的阳性药为磷酸西格列汀(350 μg·mL-1)。

1.5.2.2 对葡萄糖水平的影响随机选取5 dpf野生型AB品系斑马鱼,28 ℃处理48 h后,用水将斑马鱼清洗3遍,用血糖仪检测斑马鱼整体葡萄糖水平。

1.5.2.3 周围神经保护功效评价随机选取5 dpf转基因运动神经元绿色荧光NBT品系斑马鱼,28 ℃处理4 d后,每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照,以斑马鱼神经荧光强度的统计学分析结果评价五子衍宗丸周围神经保护功效。

1.5.2.4 周围神经炎症消退功效评价随机选取5 dpf转基因中性粒细胞荧光斑马鱼品系与外周运动神经绿色荧光斑马鱼杂交品系斑马鱼,28 ℃处理4 d后,每组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照,以斑马鱼神经周围中性粒细胞数量的统计学分析结果评价五子衍宗丸周围神经炎症消退功效。

1.6 数据分析统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析,P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 五子衍宗丸药效作用挖掘

2.1.1 化学成分及靶点收集借助BATMAN-TCM平台,收集枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子的成分及靶点,去除重复值,得到相关成分118个,相关靶点1 441个。

2.1.2 靶点的组织特异性如图1所示,使用DAVID数据库组织定位功能,可知靶点作用部位可能与神经系统、生殖、代谢、癌症以及肾脏功能等相关。

图1 疾病分类富集结果

2.1.3 药物-疾病通路关联分析如图2所示,使用DAVID平台的GAD_DISEASE子库、R:enrichDGN包进行疾病富集分析,选择P值小于0.01极其显著富集的疾病作为分析的目标。选择糖尿病等10种疾病进行通路谱关联性分析,药物-疾病通路关联的原理为假定当药物和疾病对相同的通路都有显著的影响时,药物对该疾病可能存在着调节作用,基于这个假设来计算药物与疾病的关联性。使用GeneCards数据库和DisGeNET数据库平台检索疾病并获得靶点,使用R语言对靶点进行KEGG通路富集。使用R语言对五子衍宗丸的靶点进行KEGG通路富集。选取富集的P值不大于0.01的通路计算药物-疾病的关联性。结果显示,糖尿病和阿尔茨海默病在2个平台富集均能排进前10位,阿尔茨海默病评分为2.37,而糖尿病评分为2.02。确定阿尔茨海默病和糖尿病为五子衍宗丸的潜在研究方向。

图2 GAD_DISEASE疾病富集(A)和R语言疾病富集(B)

2.2 药效学验证

2.2.1 防治阿尔茨海默病效果评价如图3所示,六水氯化铝处理斑马鱼后,光暗刺激下斑马鱼的每分钟平均运动速度、斑马鱼的运动距离均下降,与模型对照组比较,阳性对照组和五子衍宗丸组可以提高斑马鱼的反应速度和运动距离,表明五子衍宗丸可以改善反应能力,恢复运动功能障碍。如图4所示,分析不同处理组斑马鱼体内乙酰胆碱酯酶荧光值,五子衍宗丸低、中浓度与模型对照组差异不显著,高浓度组可显著降低乙酰胆碱酯酶水平,表明五子衍宗丸可能通过抑制乙酰胆碱酯酶活性达到防治阿尔兹海默病的功效。

图3 五子衍宗丸对斑马鱼每分钟光暗速度差值和运动距离的影响

图4 五子衍宗丸对乙酰胆碱酯酶(AchE)水平的影响

2.2.2 降糖效果评价如表1所示,蛋黄粉和葡萄糖处理斑马鱼后,葡萄糖水平明显升高,表明造模成功,阳性对照组和五子衍宗丸组均可降低斑马鱼葡萄糖水平。

表1 五子衍宗丸对葡萄糖水平的影响

糖尿病神经病变是糖尿病最常见的慢性并发症,病程10年以上患者易出现明显的神经病变临床表现[7]。如图5所示,随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照,统计斑马鱼神经荧光强度和神经周围中性粒细胞数量。在转基因运动神经元绿色荧光NBT品系中,模型对照组神经荧光强度降低,五子衍宗丸组神经荧光强度较模型对照组增强,表明五子衍宗丸具有保护周围神经的功效。在转基因中性粒细胞荧光斑马鱼品系与外周运动神经绿色荧光斑马鱼杂交品系中,模型对照组神经周围中性粒细胞数量增强,五子衍宗丸组神经周围中性粒细胞数量较模型对照组降低,表明五子衍宗丸具有消退周围神经炎症的功效。

A.斑马鱼神经荧光强度典型图;B.斑马鱼神经周围中性粒细胞典型图;C.五子衍宗丸处理后斑马鱼神经荧光强度;D.五子衍宗丸处理后斑马鱼神经周围中性粒细胞数量

3 讨论与结论

五子衍宗丸由枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子组成,五子衍宗丸本为补肾填精所设,在中医辨证论治观与“异病同治”思想的指导下,凡是肾虚精亏之证均可采用五子衍宗丸进行借鉴治疗[7]。本研究通过数据分析及其实验验证,探讨其在糖尿病和阿尔茨海默病的药效学作用,以期更好地指导临床应用,为今后进一步研究五子衍宗丸的应用提供思路。

3.1 五子衍宗丸与糖尿病临床研究报道表明,五子衍宗丸常和西药联合使用治疗糖尿病性勃起功能障碍或糖尿病肾病。糖尿病性勃起功能障碍是糖尿病常见并发症[8],五子衍宗丸联合十一酸睾酮胶丸治疗男性2型糖尿病合并迟发性性腺功能减退症疗效显著[9]。在西医常规治疗基础上加用五子衍宗丸加味方治疗脾肾亏虚兼瘀证Ⅲ期糖尿病肾病疗效优于单纯西医常规治疗,在调整机体的功能状态,恢复机体正气等方面也有显著疗效[10]。动物体内研究表明,五子衍宗丸加减方可以降低糖尿病大鼠的空腹血糖,促使机体恢复血糖稳态的作用,作用可能与miR-375基因调节与胰岛保护有关[11]。五子衍宗丸能减轻D-半乳糖所致的氧化损伤,抑制糖尿病性白内障小鼠晶状体组织多元醇通路的异常活跃,从而改善糖尿病性白内障小鼠晶状体的混浊程度[12]。五子衍宗丸有效部位或活性成分的研究表明,枸杞多糖具有降低血糖,增加胰岛素分泌的功效[13],菟丝子多糖能改善糖尿病大鼠糖脂代谢[14],覆盆子酮具有增加胰岛素分泌,降血糖效果[15]。车前子总苷对小鼠原代胰岛细胞及RINm5F胰岛瘤细胞胰岛损伤模型均具有治疗保护作用[16]。

3.2 五子衍宗丸与阿尔茨海默病古医籍有云,“肾精不足,则志气衰,不能上通于心,故迷惑善忘也。”阿尔茨海默病是一种中枢神经退行性疾病,在中医“肾生髓,脑为髓海”的理论指导下,常采用补肾生髓法防治痴呆[17]。采用五子衍宗颗粒治疗轻度认知障碍患者,治疗组记忆指数升高[18]。五子衍宗液可以显著改善肾虚老年男性患者脑功能,提高其瞬时记忆及逻辑故事分节记忆[19]。应用加味五子衍宗颗粒治疗轻度认知障碍患者,治疗组的记忆商均较治疗前明显提高,海马指数和颞角宽度较治疗前明显变小[20]。动物体内研究表明,采用阿尔茨海默病(AD)小鼠模型,通过Morris水迷宫定位航行试验,证明加味五子衍宗颗粒及其总黄酮、总多糖能改善AD模型小鼠的空间学习记忆能力[21]。加味五子衍宗方及有效组分能改善东莨菪碱所致记忆获得障碍模型动物的空间学习记忆成绩,对中枢胆碱能系统损伤的学习记忆障碍有保护作用[22]。五子衍宗丸有效部位或活性成分的研究表明,枸杞多糖能增强老年痴呆大鼠的学习和记忆功能[23],菟丝子总黄酮可增强神经元的可塑性和营养性,以防止神经细胞从内源性线粒体途径丢失或凋亡,进而改善内分泌衰退型痴呆小鼠的学习记忆能力[24]。五味子醇甲可通过减轻脑组织神经元变性、脱失,改善突触功能等途径起到防治老年性痴呆的作用[25]。

3.3 斑马鱼在糖尿病及阿尔茨海默病研究中的特点斑马鱼是仅次于小鼠的第二大模型生物,和哺乳动物有着相似生物结构和功能,因其具有体积小、养殖成本低、易饲养、发育快速、繁殖力强、便于观察等优势,广泛应用于医药研究领域[26]。斑马鱼与代谢调控相关的主要器官,如胰腺及胰岛素敏感的外周组织与人类相似,使得斑马鱼可以作为糖代谢的研究模型[27]。斑马鱼表现出的学习、睡觉、药物成瘾和神经保护表型也与人类相似[28],因此斑马鱼也是神经药物筛选的良好模式生物。本研究借助数据挖掘技术,建立了基于斑马鱼模型的“二次开发-活性评价”的方法,对五子衍宗丸降血糖和防治阿尔茨海默病的药效进行了评估,使数据挖掘与实验结合,有效节约实验时间,降低实验成本。

本研究利用计算二次开发的方法和斑马鱼活体试验结合的方法,发现五子衍宗丸可能对神经系统和代谢疾病产生影响。斑马鱼降糖药效试验表明,五子衍宗丸可以降低斑马鱼葡萄糖水平并改善糖尿病神经病变。防治阿尔茨海默病药效试验表明,五子衍宗丸可以改善斑马鱼反应能力,恢复运动功能,可能与抑制乙酰胆碱酯酶活性有关。