间充质干细胞外泌体在肾移植术后口腔溃疡防治中的效果观察

吴正敏,郑春燕,许艺莲

肾移植术后好发口腔溃疡,主要因机体免疫力低下、术后免疫抑制剂大剂量使用所致,出现口腔溃烂、局部肿痛等症状,导致患者进食困难、生活质量下降,影响术后营养摄取,不利于术后恢复[1]。口腔溃疡通常1～2周可自愈,该过程经历患处炎症反应、肉芽组织增生、修复上皮等一系列复杂的生物学过程;而由于肾移植术后特殊的病理生理状态,使得此类患者口腔溃疡不易自愈[2]。临床处理中多采取生理盐水清洗、清淡饮食等方式干预。间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞,可发挥分泌细胞因子、调节免疫、促进血管形成等生物功能,在非小细胞肺癌、肌腱损伤等多种疾病与损伤的治疗中作用显著[3-4]。临床处理过程中发现,含漱间充质干细胞培养上清液有利于促进口腔溃疡愈合[5]。本研究系统调查分析我院近期肾移植术后患者口腔溃疡的发生情况,并观察采用间充质干细胞外泌体治疗效果,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 基线资料及分组

选取我院2021年10月—2022年4月收治的100例肾移植术后患者,其中男71例,女29例;年龄38～61(50.68±4.97)岁;体质量指数20～27(23.79±1.13)kg/m2;原发病:慢性肾小球肾炎84例,高血压肾病7例,糖尿病肾病6例,过敏性紫癜肾炎3例;有口腔溃疡史38例。口腔溃疡诊断标准:口腔黏膜、口唇、咽部不同程度红肿、糜烂、疼痛、溃疡。纳入标准:首次肾移植;移植肾功能正常;1个月内无其他感染性疾病;免疫抑制剂方案为他克莫司+吗替麦考酚酯+甲泼尼龙;无其他口腔疾患。排除标准:伴有自身免疫功能缺陷;肾移植术前有长期免疫抑制剂用药史;有肝、肺、心等重要脏器重大手术史;治疗依从性差,无法配合本研究干预;严重营养不良;精神异常。统计术后口腔溃疡发生情况,将发生口腔溃疡患者根据干预方式的不同分为观察组和对照组。本研究征得我院医学伦理委员会同意(LW2021622),患者均知情同意并签属知情同意书。

1.2 干预方法

对照组每日3餐后用生理盐水做口腔护理,清洁口腔溃疡处,连续干预7 d。观察组在对照组基础上给予间充质干细胞外泌体喷雾剂,于生理盐水清理后喷至溃疡处,连续干预7 d。间充质干细胞外泌体制剂制备:于无菌状态下取脐带组织,PBS(1%双抗:青霉素和链霉素)洗涤,剔除组织内静动脉血管,剥离华通胶,EB病毒、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒检测合格后,剪碎至1 mm3获取样品;贴壁培养,置于α-MEM培养基(15 mL,10%胎牛血清),于5% CO2细胞培养箱中37 ℃培养12～15 d,弃细胞上清液,PBS洗涤(1%双抗),加入胰蛋白酶10 mL至液体变为白色,再加入α-MEM培养基(15 mL,10%胎牛血清),离心(1 000 r/min,5 min),接种至无血清α-MEM培养基内培养(接种密度1.6×106/mL),于5% CO2细胞培养箱中37 ℃培养72 h,再次细胞传代处理,收集上清液;离心(2 000 r/min,10 min)并除菌过滤,获取间充质干细胞外泌体溶液,经BCA蛋白浓度检测试剂盒检测溶液中外泌体浓度为0.1 mg/mL;制备成制剂,-80 ℃冻存。

1.3 观察指标

1)统计纳入肾移植术后患者的口腔溃疡发生情况。

2)干预7 d后比较2组治疗效果。干预3 d内疼痛消除,溃疡完全愈合,为显效;干预4～6 d疼痛消除,溃疡完全愈合,为有效;未达上述标准为无效[6]。将显效、有效计入总有效。

3)比较2组口腔溃疡病情及恢复情况,包括进食恢复时间、疼痛消失时间、溃疡愈合时间。

4)比较2组治疗前及治疗3、7 d后口腔pH值,唾液免疫球蛋白[分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、溶菌酶(Lys)、免疫球蛋白G(IgG)]水平。口腔pH值采用pH试纸检测,浸润唾液10 s后取出获取pH值。唾液采集:采集前30 min漱口,舌尖抵住上颚或下颚齿根,向椭圆形漏斗中吐入唾液,直至唾液达2 mL填充线高;采用双抗夹心酶联免疫吸附试验检测唾液sIgA、IgG水平,采用平板打孔测定法检测Lys水平。

5)比较2组治疗前及治疗3、7 d后血清白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β(TGF-β)、前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。采集空腹静脉血4 mL,离心(3 500 r/min,10 min)取血清,采用酶联免疫吸附试验检测。

6)比较2组治疗前及治疗3、7 d后病情评分。a.采用疼痛视觉模拟评分法(VAS)评分评估口腔疼痛程度,计分0～10分,0分表示无疼痛,10分表示剧烈疼痛,分值越高表示疼痛程度越剧烈;b.采用口腔评估指南(OAG)评分评估口腔溃疡症状严重程度,该量表采用1～3分3级评分制,共8个条目,总分8～24分,分值越高说明口腔溃疡症状越严重;c.采用口腔健康影响程度量表(OHIP-14)评估口腔健康状态,该量表包括7个条目,采用0～4分5级评分法,总分0～56分,分值越低提示口腔健康状态越好。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 肾移植术后口腔溃疡发生情况

100例肾移植术后患者中有40例发生口腔溃疡,60例未发生口腔溃疡。

2.2 治疗效果比较

将40例肾移植术后发生口腔溃疡患者根据治疗方法不同分成观察组20例和对照组20例,2组性别、年龄、体质量指数、术后溃疡发生时间、单个溃疡面直径、溃疡数量比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。观察组总有效率为95.00%高于对照组的65.00%(P<0.05),见表2。

表1 2组肾移植术后口腔溃疡患者一般资料比较

表2 2组肾移植术后口腔溃疡患者治疗效果比较[例(%)]

2.3 口腔溃疡病情及恢复情况比较

观察组进食恢复时间、疼痛消失时间、溃疡愈合时间均短于对照组(P<0.05,P<0.01)。见表3。

表3 2组肾移植术后口腔溃疡患者及恢复情况比较

2.4 治疗前后口腔pH值、唾液免疫球蛋白比较

治疗3、7 d后2组口腔pH值、唾液sIgA水平均较治疗前升高,唾液Lys、IgG水平均较治疗前降低,且治疗7 d后口腔pH值、唾液sIgA水平均较治疗3 d后升高,唾液Lys、IgG水平较治疗3 d后降低(P<0.05);治疗3、7 d后观察组口腔pH值、唾液sIgA水平高于对照组,唾液Lys、IgG水平低于对照组(P<0.05,P<0.01)。见表4。

表4 2组肾移植术后口腔溃疡患者治疗前后口腔pH值、唾液免疫球蛋白比较

2.5 治疗前后血清炎性因子比较

治疗3、7 d后2组血清IL-6、TGF-β、PGE2、TNF-α水平均较治疗前下降,且治疗7 d后各项血清炎性因子均较治疗3 d后下降(P<0.05);治疗3、7 d后观察组血清IL-6、TGF-β、PGE2、TNF-α水平均低于对照组(P<0.01)。见表5。

表5 2组肾移植术后口腔溃疡患者治疗前后血清炎性因子比较

2.6 治疗前后病情评分比较

治疗3、7 d后2组OAG评分、VAS评分、OHIP-14评分均较治疗前下降,且治疗7 d后各病情评分均较治疗3 d后下降(P<0.05);治疗3、7 d后观察组OAG评分、VAS评分、OHIP-14评分均低于对照组(P<0.05,P<0.01)。见表6、表7。

表6 2组肾移植术后口腔溃疡患者治疗前后OAG、VAS评分比较分)

表7 2组肾移植术后口腔溃疡患者治疗前后OHIP-14评分比较分)

3 讨论

肾移植术后由于大量应用免疫抑制剂、广谱抗生素,加之原发病进展过程中微量元素缺乏、激素水平改变、免疫力降低、饮食等因素,使得口腔溃疡发生率较高且不易治愈,但查阅文献发现,临床研究中尚缺乏确切的统计数据[7]。本研究统计显示,100例肾移植术后患者中有40例发生口腔溃疡,可见探究肾移植术后口腔溃疡的有效干预方法意义重大。现阶段对于口腔溃疡主要以对症治疗、减轻疼痛为原则,促进溃疡愈合。由于肾移植术后口腔溃疡不仅导致患者口腔局部疼痛,且影响患者正常进食,可能继发营养不良,影响患者术后恢复。而此类患者给予免疫抑制、抗炎治疗必不可少,为口腔溃疡的临床干预带来困难。

经病理学分析,口腔溃疡发生后黏膜固有层中胶原纤维水肿、玻璃样变性断裂、弯曲紊乱或均质化,甚者胶原纤维破坏、消失[8-9]。外泌体是包裹有核酸、蛋白质的脂质双分子层小囊泡,作为细胞间通讯的重要介质可携带间充质干细胞的胞内蛋白、mRNAs、膜蛋白,进而发挥多种病理生理功能,促进血管生成、抑制免疫细胞活性等[10-13]。本研究显示,观察组总有效率高于对照组,且进食恢复、疼痛消失、溃疡愈合时间均有所缩短,提示间充质干细胞外泌体治疗肾移植术后口腔溃疡效果较好。毛水红等[14]研究表明,脐带间充质干细胞有利于重度糖尿病足溃疡患者创面愈合。sIgA属局部抗菌免疫球蛋白,其水平在病原菌侵入时下降,可反映口腔感染情况;唾液中IgG在口腔黏膜受损时升高;Lys具有抗感染、免疫调节功能[15-16]。肾移植术后患者口腔内环境偏酸,本研究显示治疗3、7 d后观察组口腔pH值、唾液sIgA水平高于对照组,唾液Lys、IgG水平低于对照组。GUAN等[17]报道显示,骨髓间充质干细胞可增加唾液与唾液蛋白分泌,间充质干细胞可改善动物模型放射性口腔溃疡的微观、宏观形态。

本研究结果显示,治疗3、7 d后干预组血清IL-6、TGF-β、PGE2、TNF-α水平及OAG评分、VAS评分、OHIP-14评分均低于对照组,表明在生理盐水常规护理基础上应用间充质干细胞外泌体可明显缓解肾移植术后患者口腔溃疡疼痛感,减轻口腔溃疡炎症反应,提高治疗效果。生理盐水冲洗溃疡处可起到清洁口腔、缓解局部疼痛、促进愈合等作用,但口腔溃疡表面常覆盖着炎性分泌物,单纯生理盐水无法达到消炎抑菌作用[18]。而间充质干细胞外泌体能通过旁分泌作用介导干细胞80%的治疗作用,使外泌体携带的蛋白质等纳米颗粒被受体细胞内吞,参与细胞间通讯,诱导CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞增殖,促进组织修复[19-20]。此外,间充质干细胞外泌体含有成纤维细胞生长因子、TGF、血管内皮生长因子等有促血管生成作用的效应分子,激活核因子-κB信号通路,调节血管生成,进而促进创面肉芽组织修复,改善患者口腔健康[21]。

综上,肾移植术后易发生口腔溃疡,肾移植术后口腔溃疡患者应用间充质干细胞外泌体干预效果较好,可有效缩短患者溃疡愈合时间,缓解炎症反应,减轻溃疡疼痛,促进患者口腔健康。