CCR10通过NRF2抑制结直肠癌细胞铁死亡的机制研究

徐昰栋,刘子梅,陈 宁,褚敬申,姜晓星,刘湘帆,马俐君

(1.上海交通大学医学院附属同仁医院 肿瘤科,上海200336;2.上海交通大学医学院 医学技术学院,上海200025;3.上海交通大学医学院附属瑞金医院 科技发展处,上海200025)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,约占全球每年新发癌症的10%[1-2],发病机制尚未完全明确。铁死亡是一种铁依赖、由脂质过氧化和随后的质膜破裂而引起的细胞程序性死亡[3]。铁死亡主要通过两种途径启动,外源性途径是抑制胱氨酸/谷氨酸转运体(系统XC-)或激活铁转运体血清转铁蛋白和乳转铁蛋白;内源性途径主要是抑制细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione Peroxidase 4,GPX4)[4]。铁死亡诱导剂(ferroptosis inducers,FINS)已被发现可以和传统疗法结合治疗癌症[5]。Erastin和rsl3是铁死亡研究中常用的两种FINs,其中Erastin可抑制溶质载体家族7成员11(SLC7A11)摄取胱氨酸并限制细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽水平[6-7],rsl3可抑制GPX4的催化活性[8]。C-C趋化因子受体10(C-C chemokine receptor 10,CCR10)是一种G蛋白偶联受体,在肿瘤中的具体功能与机制尚不十分明确。本研究旨在结合生物信息学分析和实验验证,深入研究CCR10在结直肠癌细胞铁死亡过程中的作用和分子机制,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

HCT 116细胞系购自中国科学院(上海)细胞库,胎牛血清来自美国Crystalgen公司,McCOY’s 5A培养基来自美国Cytiva公司,青链霉素双抗和胰蛋白酶来自美国Gibco公司;Lipo2000购自美国Invitrogen公司,CCR10过表达慢病毒及其阴性对照,CCR10过表达质粒及其空载对照,瞬时转染核因子E2相关因子2(NRF2)过表达质粒及其空载对照均由上海和元生物构建,CCR10敲除慢病毒及其阴性对照购自上海碧云天技术有限公司;CCK8试剂盒购自苏州新赛美生物,PCR相关试剂购自湖南艾科瑞生物,结晶紫购自上海碧云天技术有限公司;铁死亡诱导剂erastin、rsl3购自美国Selleck公司,CCR10抗体购自美国Proteintech公司,铁死亡抗体样品试剂盒(Ferroptosis Antibody Sampler Kit)、β-tubulin、GAPDH抗体购自美国CST公司;4周龄BALB/c雄性裸鼠来自上海维通利华。

1.2 GEPIA数据库分析

使用基于TCGA和GTEx数据的快速个性化分析网站(http://gepia2.cancer-pku.cn/),分析CCR10在结直肠癌中与铁死亡相关基因的共表达情况。

1.3 细胞培养和稳转细胞系的构建

使用含10%胎牛血清和1%双抗的McCOY’s 5A培养基在37℃、5%CO2条件下培养HCT 116细胞,用含有CCR10靶向sgRNA(CCR10-KO)和cDNA(CCR10-OE)的慢病毒载体转染HCT 116细胞。空载体转染的细胞用作敲除或过表达的阴性对照。用嘌呤霉素(8 μg/ml)筛选得到稳定转染细胞系。

1.4 CCK8法和克隆形成检测细胞增殖和细胞活力

CCK8法:将细胞接种于96孔板,待细胞贴壁后,每组加入相应浓度的erastin(12 μM)或rsl3(4 μM)培养24 h,再加入CCK8试剂孵育2 h,每组细胞设置6个复孔,用酶标仪于450 nm波长处测定其吸光度值。克隆形成实验:6孔板每孔铺设细胞1000个并培养14 d,或每孔铺设5000个细胞待贴壁后并分别加入DMSO/erastin/rsl3培养14 d。多聚甲醛固定,结晶紫染色,肉眼观察。

1.5 qRT-PCR实验

用总RNA提取试剂盒(AG,#AG21024))提取上述细胞系总RNA,逆转录合成cDNA,使用qPCR试剂盒和相关引物进行qRT-PCR。引物序列:CCR10正向序列5’-CTGCTGGATACTGCCGATCTAC-3’,反向序列5’-AGGAAGGCGTAGAACGGGGAT-3’。NRF2正向序列5’-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3’;反向序列5’-GGAATGTCTGCGCCAAAAGCTG-3’。GAPD正向序列5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’;反向序列5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。GAPDH作为内参。然后用2-△△Ct方法计算每个基因表达水平。

1.6 Western blot

在冰上用RIPA裂解细胞提取总蛋白,经过电泳、转膜、封闭,使用CCR10、GAPDH或β-tubulin、Ferroptosis Antibody Sampler Kit一抗(CST)及山羊抗兔HRP偶联的二抗(CST)孵育,显影仪检测相关蛋白表达。

1.7 C11-BODIPY染色和流式细胞学检测脂质过氧化

用C11-BODIPY 581/591(MCE,#HY-D1301)检测脂质过氧化反应。经DMSO/erastin/rsl3处理24 h后,细胞与C11-BODIPY(5 μM)在37℃、5%CO2培养箱中避光孵育60 min。孵育结束后,加入1 mL PBS洗涤细胞,以1 000 r/min离心5 min后收集细胞,最后用500 μL PBS重悬细胞,用流式细胞术进行检测。染料的羟基自由基氧化导致荧光发射峰从～591 nm移动到～510 nm。

1.8 裸鼠异种移植瘤实验

将HCT 116细胞悬液(4×106个/200 μL)注射到4周龄雄性BALB/c裸鼠的右侧背侧皮下。将小鼠随机分为2组,每组6只:(1)接种NC细胞;(2)接种CCR10-KO细胞。所有小鼠在肿瘤最大直径达到15 mm之前被处死。肿瘤体积按0.5×长×宽2计算。每3 d监测一次肿瘤体积。本实验由上海交通大学医学院附属同仁医院实验动物伦理委员会批准。

1.9 统计学方法

所有数据使用GraphPad Prism8.0软件进行分析,通过t检验或单向ANOVA分析统计差异并经过正态分布检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。所有数据都来自至少三个独立重复的实验。

2 结果

2.1 CCR10与铁死亡相关基因共表达的生信分析

利用GEPIA分析CRC患者组织中铁死亡相关基因与CCR10的共表达情况,其中CCR10与铁死亡抑制基因B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)(r=0.54,P<0.001)、重肽铁蛋白(FTH1)(r=0.18,P<0.01)和NRF2(r=0.31,P<0.001)呈正相关(见图1A),与铁死亡驱动基因肿瘤蛋白P53(TP53)(r=-0.46,P<0.001)、转铁蛋白受体1(TFRC)(r=-0.45,P<0.001)和胞质接头蛋白Keap1(KEAP1)(r=-0.29,P<0.001)呈负相关(见图1B),提示CCR10与铁死亡具有密切相关性。

图1 GEPIA数据库分析CCR10与铁死亡相关基因共表达关系

2.2 建立CCR10过表达和敲除细胞株

qPCR实验结果显示,相较于其阴性对照组(NC),CCR10-OE组的CCR10 mRNA的表达水平升高约20倍,而CCR10-KO组CCR10 mRNA表达水平约降低为原来的1/10(见图2A)。WB实验证明CCR10-OE蛋白表达水平显著升高,而CCR10-KO组的CCR10蛋白表达水平显著降低(见图2B),提示HCT 116 CCR10过表达和敲除细胞株构建成功。

图2 病毒感染HCT116细胞后CCR10过表达及敲除情况

2.3 CCR10对于细胞增殖的影响

CCK8细胞活力实验结果表明,CCR10过表达促进了细胞增殖,而CCR10敲除则抑制了这一作用(见图3A)。同样地,CCR10过表达或敲除分别增加或抑制两种细胞的集落形成(见图3B)。

图3 CCR10过表达及敲除后对结直肠癌细胞增殖的影响

2.4 CCR10敲除影响小鼠皮下异种移植瘤生长

将CCR10-KO的HCT 116细胞注射至裸鼠皮下后形成的肿瘤小于注射对照细胞的裸鼠(见图4A、4B),CCR10-KO的HCT116细胞种植后形成的肿瘤体积(见图4C)和重量(见图4D)较对照组相比明显缩小,提示CCR10基因敲除明显抑制了肿瘤在小鼠体内的生长。

图4 CCR10敲除后在体内对结直肠癌细胞增殖的影响

2.5 CCR10对于erastin和rsl3诱导的细胞死亡的影响

分别用两种铁死亡诱导剂erastin和rsl3处理CCR10过表达和敲除的HCT 116细胞。CCK8细胞活力实验(见图5A、5B)和克隆形成实验(见图5C)显示erastin或rsl3处理细胞均可导致细胞死亡,而过表达CCR10时,可显著抑制erastin和rsl3诱导的细胞死亡;反之,当CCR10表达下降时,细胞则对2种铁死亡诱导剂敏感性增强。结果表明,CCR10表达会影响细胞对铁死亡的反应。

图5 CCR10过表达及敲除后结直肠癌细胞对铁死亡诱导剂杀伤作用的变化

2.6 CCR10对于细胞脂质过氧化的影响

流式细胞术检测各组细胞经erastin或rsl3处理24 h后的脂质过氧化水平,结果表明,CCR10-OE组相对于对照组,脂质过氧化比例明显下降(见图6A),而CCR10-KO组相对于对照组,脂质过氧化比例则明显上升(见图6B)。在CCR10-KO细胞株中回补CCR10质粒(见图6C)则相对其空载对照逆转了脂质过氧化水平。

图6 CCR10过表达或敲除后对结直肠癌细胞脂质过氧化水平的影响

2.7 CCR10蛋白表达水平与多种铁死亡相关蛋白的关系

分别提取CCR10过表达和对照细胞,CCR10敲除和对照细胞的总蛋白,利用Western blot检测上述样本铁死亡相关蛋白质的表达水平(见图7)。结果显示,过表达CCR10显著增加了铁死亡抵抗蛋白NRF2、SLC3A2、SLC40A1、SLC7A11、GPX4、FTH1蛋白的水平,降低了铁死亡驱动蛋白NCOA4的水平。而在CCR10敲除组中这些与铁死亡相关的蛋白水平呈现与过表达组相反的趋势,进一步证明了CCR10的表达与铁死亡呈负相关,并明显改变了铁死亡途径中多个关键蛋白质的表达水平。

图7 WB检测CCR10过表达及敲除后HCT116细胞铁死亡相关蛋白的变化

图8 CCR10通过NRF2影响铁死亡下游基因SLC7A11、GPX4和FTH1

2.8 NRF2是CCR10抑制结直肠癌铁死亡通路的关键分子

NRF2是已知的抑制铁死亡的重要分子,可直接影响SLC7A11、GPX4和FTH1的表达。前面结果已证明CCR10影响NRF2蛋白表达。进一步进行qPCR实验,结果表明CCR10的过表达可引起NRF2转录水平升高,而敲除CCR10则使NRF2转录水平下降(见图8A)。为了进一步明确CCR10与NRF2的关系,采用了NRF2的补充实验。在CCR10-KO的HCT116细胞中转染NRF2质粒及其空载,在mRNA(见图8B)和蛋白质(见图8C)水平分别验证其成功转染。CCK8结果表明,经erastin和rsl3处理后,转染NRF2的CCR10-KO细胞相对存活率得以恢复(见图8D),即回补NRF2可恢复细胞对铁死亡的敏感性,并分别检测SLC7A11、GPX、FTH1的mRNA水平(见图8E)和蛋白质水平(见图8F),结果显示,当回补NRF2后,SLC7A11、GPX4和FTH1表达水平相应升高,也验证了NRF2作为SLC7A11的上游转录因子的效应。上述结果提示,CCR10可以通过NRF2表达上调而抑制结直肠癌细胞的铁死亡。

2.9 CCR10通过NRF2抵抗铁死亡

结果表明,CCR10可能通过上调转录因子NFR2表达,影响下游的SLC7A11、GPX4和FTH1等铁死亡重要蛋白质表达,从而引起细胞脂质过氧化水平降低,进而发挥抵抗结直肠癌细胞对铁死亡的敏感性(见图9)。

图9 CCR10通过NRF2抵抗铁死亡

3 讨论

结直肠癌具有复杂性、异质性和通过各种手段逃避免疫监视的能力[9],因此有必要对结直肠癌分子机制进行深入研究,采取多靶点、多途径的个体化治疗。近年诱导铁死亡是一种治疗肿瘤新的治疗策略,铁死亡激活剂因其巨大的治疗潜力而引起了癌症研究的极大兴趣[10]。

铁死亡是一种独特的调节细胞死亡的形式,最早由DIXON等[11]在2012年描述为一种非凋亡性、铁依赖的细胞死亡形式。这一过程在形态、生化和遗传方面不同于其他类型的细胞死亡,如细胞凋亡、坏死和自噬等[3]。铁死亡的关键生化特征包括过氧化脂质的积累和谷胱甘肽的耗竭,其中谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂分子,其耗竭会导致活性氧(ROS)水平升高和氧化应激,最终导致细胞死亡[12]。铁死亡已被证明在抑制肿瘤和耐药性方面发挥作用。在癌细胞中诱导铁死亡可以增加它们对化疗、放射治疗和免疫治疗的敏感性[13],如erastin可以提高化疗药物,如顺铂、多西他赛、替莫唑胺等药物杀伤肿瘤的作用。免疫治疗是最新型的肿瘤治疗模式,研究发现当使用铁死亡抑制剂liproxstatin-1后,程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的免疫抑制作用会明显降低,提示铁死亡在免疫治疗中发挥重要作用。此外,结直肠癌存在多种基因突变,其中KRAS基因突变率约占40%,也是造成CRC治疗出现耐药性的重要原因,现已有报道CRC细胞对铁死亡的敏感性与KRAS突变耐药性关系密切[14],然而目前已知的FINs都无法作为药物应用于临床,因此寻找能够增强铁死亡敏感性的基因对加强化疗药物、靶向药物、免疫治疗的疗效以及减少耐药性出现将具有积极的临床意义。

本研究通过CCR10与多个铁死亡重要基因共表达的生物信息学研究发现,CCR10与铁死亡关系极为密切,且表现为CCR10是铁死亡的负性基因。在以往的研究中,CCR10研究主要集中在它的两个配体,即趋化因子配体27(chemokine ligand 27,CCL27)和趋化因子配体28 (chemokine ligand 28,CCL28)[15-17]。CCR10/CCL27-CCL28轴被认为介导免疫细胞的迁移和定位,参与肿瘤免疫监视、生长和转移,基于该轴设计的治疗方法可能在肿瘤治疗中具有一定的应用前景[18]。CCL27作为一种趋化因子,可以吸引T细胞和NK细胞进入肿瘤微环境,抑制肿瘤生长[19-20],而CCL28被认为是肝癌、肺癌和结直肠癌的侵袭因子[18],可能参与肿瘤的发生发展。总之,CCR10/CCL27-CCL28轴是肿瘤发生发展的一把双刃剑[21],而本研究揭示了CCR10除了与配体的作用外,可能直接参与结直肠癌细胞铁死亡。

研究发现CCR10能抑制细胞铁死亡,促进结直肠癌细胞增殖,而当CCR10基因表达缺失时,可以启动铁死亡,细胞增殖能力则明显减弱,同样的结果也在体内动物实验中得以验证。明确CCR10与铁死亡的关系后,本研究进一步探讨CCR10调控铁死亡的机制。其中胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白(System xc-)是细胞内重要的抗氧化体系,参与细胞内谷胱甘肽(GSH)生成。GSH是谷胱甘肽过氧化物酶的还原性辅助因子,那么抑制System xc- 活性即抑制GSH的合成,继而降低GPX4活性,细胞抗氧化能力降低,导致细胞膜脂质过氧化物的累积,从而促进铁死亡,这是铁死亡的最重要的途径之一。System xc-由SLC7A11和SLC3A2两个亚基组成,其中SLC7A11是系统XC-中的转运蛋白亚基[6,22],对胱氨酸/谷氨酸具有强特异性。本研究发现,CCR10基因变化会导致NRF2基因表达的明显改变。NRF2是一个转录因子,它对SLC7A11具有转录调节作用。通过上调NRF2可引起下游SLC7A11、GPX4、FTH1等基因表达升高,而在CCR10敲除的细胞中转染NRF2进行补偿验证时,铁死亡表型发生了逆转,SLC7A11、GPX4等表达也发生了反向改变。上述结果提示CCR10可以通过NRF2的升高影响SLC7A11/GPX4通路,从而降低CRC对铁死亡诱导剂的敏感性。

综上,本研究明确了CCR10可以抑制结直肠癌细胞对铁死亡的敏感性,促进结直肠癌细胞的增殖。CCR10改变铁死亡表型可能是通过转录因子NFR2,影响下游SLC7A11、GPX4等关键基因转录而实现的。那么CCR10是否具有肿瘤靶点治疗的潜力,其靶点封闭是否具有与化疗、靶向治疗等协同作用的价值,都值得未来进行深入研究。