基于高通量测序的海州湾沉积物中微生物多样性分析

顾 颖，伏光辉，王亚东，叶仁智，卢 璐，孙苗苗*

（1.连云港市海洋与渔业发展促进中心，江苏连云港 222000；2.江苏海洋大学，江苏连云港 222000）

海州湾是位于江苏省连云港市沿岸的开放型浅海海湾，其底质类型丰富、入海河流众多、生物饵料丰富，是我国重要的渔场之一[1-2]。然而，近年来由于资源保护不当、过度捕捞、环境污染等因素的影响，海州湾资源急剧衰退，影响了海州湾海洋生态系统的可持续健康发展[3]。海洋微生物是海洋生态系统的重要组成部分，参与海洋生物地球化学循环过程，在海洋生态系统的功能中具有重要作用[4-5]。相关研究表明，微生物群落特征的变化会影响海洋碳、氮和磷等营养物的化学循环及微生物的降解功能[6-8]。沉积物在海洋生态系统中通常具有较高的微生物丰度和多样性，其中的微生物是调节各种生物元素转化和生物修复的生物地球化学过程的主要执行者[9-10]。因此，对沉积物中微生物多样性的研究有助于了解海洋微生物群落的分布特征，维持海洋生态资源的可持续发展。目前，对海州湾的研究主要集中在鱼类多样性、浮游动植物多样性和海洋环境研究等方面[1-3,11-16]，对海州湾沉积物中微生物多样性的研究较少。鉴于此，本研究以海州湾不同点位的沉积物样品为研究对象，利用Illumina MiSeq 高通量测序技术，对海州湾水域沉积物的微生物多样性进行了分析，以期为海州湾海域生态系统的健康发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

参照黄备等[17]的方法进行沉积物样品采集。沉积物样品采集于江苏省连云港市海州湾，采样点布设如表1所示。每个点位各采集3 g沉积物，3次重复。

表1 海州湾采样点布设

1.2 DNA提取及高通量测序

参照张帅等[18]的方法，称取0.5 g 新鲜沉积物样品，采用磁珠式土壤基因组DNA 提取试剂盒（Omega公司，美国）提取样品总群落基因组DNA，利用Qubit 4.0（Thermo 公司，美国）检测DNA 浓度后，对细菌16S rRNA基因的V3-V4区进行PCR扩增。扩增后的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用Illumina MiSeq系统（Illumina MiSeq，USA）进行双端测序。

1.3 数据分析

对高通量测序得到的样本数据进行质控过滤以得到有效数据[19-21]。利用Usearch 11.0.667 软件将相似性＞97%的序列聚类为一个OUT[22-23]。通过Mothur 1.43.0软件计算序列的α-多样性指数[24]，其中，Chao1和Ace指数用于评估群落分布丰度，Shannon和Simpson指数用于评估群落分布多样性，Shannoneven指数用于评估群落分布均匀度，Coverage 指数能够反映测序结果是否代表样本的真实情况。

2 结果与分析

2.1 微生物α-多样性分析

对海州湾水域各样点采集样品进行α-多样性分析，多样性指数统计结果见表2。Shannon 指数越大，Simpson指数越小，说明微生物群落多样性越高。RA8点位沉积物样品的Shannon 指数最大（6.192），且Simpson指数最小（0.007），表明RA8点位沉积物样品的微生物群落多样性最高。各采样点沉积物样品的Chao1 指数和Ace 指数不同，表明不同沉积物样品的微生物群落丰度不同。此外，各样品的Coverage 指数均接近1（p＜0.01），表明样本测序结果能够代表样本微生物的真实情况。

表2 海州湾水域各样点细菌群落α-多样性指数分析

2.2 微生物PCoA分析

基于UniFrac 距离算法，在OUT 水平上，对海州湾沉积物样品进行主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）。结果如图1（见封三）所示，坐标轴PCo1 能解释45.67%的微生物群落组成差异，第二坐标轴PCo2 能解释25.67%的微生物群落变化。在PCo1维度上，RA8点位的沉积物样品与其他点位的沉积物样品距离均较远，表明RA8 点位与其他点位的沉积物样品的微生物群落结构差异较大。此外，CA3、RA6 点位沉积物样品的微生物群落结构差异较小，CA1、RA9、RA16 点位沉积物样品的微生物群落结构差异较小。

2.3 微生物群落组成分析

通过blastn 将序列与RDP、GTDB、NCBI、Silva和UNITE 等数据库进行比对，进行物种注释，海州湾沉积物样品中共发现2 851 个OUTs，分属于31 门74纲116 目199 科331 属。门水平上（图2，见封三），海州湾水域主要优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和硬壁菌门（Firmicutes）等8 类。其中，各采样点的第一优势门类均为变形菌门，分别占各样品细菌群落丰度的62.39%、53.15%、54.30%、57.97%、56.09%、58.93%。除RA8、CA3 点位外，拟杆菌门在其他点位沉积物中的含量仅次于变形菌门，平均相对丰度为7.76%。

选取在属水平上相对丰度排名前22位的细菌优势菌属做热图分析，如图3（见封三）所示，颜色越红表示物种相对丰度越高，越绿表示相对丰度越低。不同点位的沉积物样品中的优势菌属存在一定差异。RA8点位沉积物样品中相对丰度最高的菌属为Gp10，相对丰度为3.38%，Sulfurovum（2.23%）、Thioprofundum（3.17%）和Gp23（2.28%）也是RA8 点位沉积物样品中的优势菌属，平均相对丰度均超过2%；Sulfurovum是RA6、RA16 点位沉积物样品中的最优势菌属，相对丰度分别为10.43%、6.02%；Thioprofundum是RA9、CA1 点位沉积物样品中的最优势菌属，相对丰度分别为3.40%、3.94%；此外，CA3点位沉积物样品中相对丰度最高的菌属为Gp10，相对丰度为3.36%。

应用属水平的Venn 图分析6 个点位沉积物样品的微生物群落差异（图4，见封三）。6 个点位样品共有的物种有191 个属，特有的物种分别为CA3 点位4 个，RA6 点位3 个，RA8 点位9 个，RA9 点位3 个，RA16点位6个，CA1点位4个。表明6个点位微生物的种类组成具有较高的相似性，各点位特有的微生物种类较少。

2.4 共表达网络分析

通过计算物种之间的相关性，建立物种相关性网络，共表达网络特征值如表3所示，共表达网络如图5（见封三）所示。16 个节点间有27 条表示种间强相互作用的连接（p＜0.05，r＞0.8），平均路径长度是1.65，网络直径为4，紧密系数为0.64。网络中的节点主要属于变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和放线菌门4个菌门，也是细菌群落的优势菌门。

表3 共表达网络特征值

2.5 FAPROTAX分析

通过FAPROTAX 软件分析预测微生物的功能，样本细菌的FAPROTAX 功能丰度热图如图6（见封三）所示。结果表明，各采样点沉积物样品的功能丰度基本相似，微生物的主要功能与硫化合物呼吸（respiration of sulfur compounds）、亚硫酸盐呼吸（sulfate respiration）、化能异养（chemoheterotrophy）、有氧化能异养（aerobic chemoheterotrophy）、发酵（fermentation）、硫酸盐呼吸（sulfite respiration）、光合作用（chloroplasts）、光合营养（phototrophy）、光能自养（photoautotrophy）、无氧光能自养（anoxygenic photoautotrophy）、硝化（nitrification）、亚硝酸盐氧化（aerobic nitrite oxidation）、尿素分解（ureolysis）、含硫化合物暗氧化（dark oxidation of sulfur compounds）、动物寄生虫共生体（animal parasites or symbionts）、硫暗氧化（dark sulfur oxidation）、亚硫酸盐暗氧化（dark sulfite oxidation）、硝酸盐还原（nitrate reduction）及光能异养（photoheterotrophy）等有关。其中，硫化合物呼吸占5.9%～10.68%，亚硫酸盐呼吸占5.74%～10.61%，化能异养占6.1%～7.38%。

3 讨论

海洋沉积物是海洋生态系统中主要的微生物聚集地，蕴藏着丰富的微生物资源，多种营养物质转化在此进行，是参与生物地球化学循环的重要环节[25]。海洋沉积物中微生物多样性在维持海洋生态系统平衡的过程中非常重要，其相关研究已成为热点。在门水平上，变形菌门广泛参与海洋的生物地球化学循环过程，在有机物分解和循环中有重要作用[26]。白洁等研究发现黄海西北部沉积物样品中的变形细菌门在所有样品中均为优势菌门[27]；刘欣等研究发现胶州湾海域表层沉积物样品中绝对优势菌群为变形菌门[28]；黄备等研究发现椒江口海域沉积物样品中的最主要优势门为变形菌门[29]；有小娟等研究发现变形菌门为象山港内西沪港海域沉积物样品中的最主要优势门[30]。本研究中，变形菌门在海州湾各个点位的相对丰度均最高，在细菌群落中占绝对优势，与国内已报道的黄海、威海、胶州湾、椒江口及西沪港等海域沉积物样品的最大优势类群相同[27-31]。除变形菌门外，海州湾沉积物样品中还发现拟杆菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、放线菌门、浮霉菌门、疣微菌门和硬壁菌门等优势细菌门，这些菌门在我国近海沉积物微生物群落中均有报道[32-34]。此外，海州湾不同点位沉积物样品间的优势菌属及海州湾与其他海域沉积物间的优势菌属均存在较大差异，可能与环境温度、季节、深度等环境条件及受陆地、人类活动影响不同有关[28,35]。

微生物群落间的相互作用对维持生态系统结构功能稳定具有重要意义，对微生物群落共现网络的研究能够进一步认识微生物之间的相互作用[36-37]。杨艳等研究发现长江三峡上游水域样品微生物共现网络中的节点主要属于变形菌门、蓝细菌门和拟杆菌门，占所有节点的87.5%[37]；王洵等研究发现横山水库表层水样和底层水样微生物共现网络中的主要优势物种为变形菌门、放线菌门和拟杆菌门[38]。本研究发现，海州湾沉积物样品共现网络中，大多数节点属于变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和放线菌门，与其他微生物相比，这些微生物在维持网络结构和功能中起重要作用[37]。如变形菌门、绿弯菌门和放线菌门广泛参与碳、氮、硫等一系列重要元素生物地球化学循环过程，酸杆菌门在各生态系统中均具有特定的驱动作用及菌群稳定性功能[39-44]。此外，相关研究表明，丰度较高的中心微生物能够通过数量变化，丰度较低的中心微生物能够通过介体、传递及联络等功能影响微生物群落的结构组成和多样性[37,45]。

海洋沉积物中的微生物驱动碳、氮和硫等许多的生物地球化学循环[46]。FAPROTAX 预测的功能集中在海洋和湖泊中微生物的生物地球化学循环，适用于有关S 循环、N 循环、H 循环及C 循环等的功能预测[47]。例如，王璐采用FAPROTAX 软件对黄海北部海洋牧场海水和沉积物细菌群落进行功能预测，研究发现黄海海水和沉积物微生物优势功能类群主要与碳、氮元素循环有关，包括化能异养、有氧化能异养、光合作用、光合营养、光能自养、有氧光能自养、硝化、氨氧化、发酵、硝酸盐还原等[48]；李明月等通过FAPROTAX 数据库预测渤海和南黄海表层沉积物中细菌功能，研究发现目标站位沉积物中蕴含着活跃的硫化合物呼吸、硫酸盐呼吸、化能异养、有氧化能异养、光合作用、硝化及好氧亚硝酸盐氧化等硫循环、碳循环和氮循环功能[49]。在本研究中，通过FAPROTAX 预测发现海州湾沉积物样品中的微生物与硫化合物呼吸、亚硫酸盐呼吸、化能异养、有氧化能异养、发酵、硫酸盐呼吸、硝化、亚硝酸盐氧化等硫循环、碳循环和氮循环等功能有关，主要参与生物地球化学循环中的硫循环。