硫氰酸红霉素降低杂质B精制工艺研究

＊郭佳 黄延智

（宁夏泰益欣生物科技股份有限公司 宁夏 750205）

红霉素为红色链霉菌培养分离而来，属于大环内酯类抗生素的一种，具有广谱的抗菌特性，尤其对革兰氏阳性菌抗性更为敏感，如肺炎球菌、白喉杆菌、葡萄球菌、化脓性链球菌及炭疽杆菌等引起的感染[1]。红霉素为脂溶性物质，易溶于有机溶剂，极难溶于水、味苦、口感不佳是其在临床中的最大缺陷，硫氰酸红霉素是红霉素的硫氰酸盐，这种盐类增加了在水中的溶解性，又能保留红霉素的抗菌活性，因此在临床中得到了广泛的应用。硫氰酸红霉素在临床中抗菌机理为：通过皮下注射或口服进入机体后，硫氰酸红霉素中硫氰酸基团被脱除，红霉素能够特异性与细菌核蛋白体50S 大亚基的P 位结合改变核蛋白体结构或使其失活，抑制细菌蛋白、核酸的合成从而达到抑菌的效果[2]。

红霉素主要通过生物发酵法制备而来，其化学分子结构由14 元环的红霉素内酯环、红霉糖和脱氧氨基己糖通过糖苷键链接而成[3]。红霉素A（ErA）为主要的活性产物，也是在抗菌过程中发挥主要作用的物质，红霉素A 在偏碱性环境中活性较高，酸性条件下红霉素A 活性降低甚至降解[4]。另外，生物发酵过程中也会产生一些红霉素A 的异构体，分别为红霉素B（ErB）、红霉素C（ErC）、红霉素D（ErD）、红霉素E（ErE）和红霉素F（ErF），这些物质与红霉素A 结构特性相似，因此在提取过程中这几种杂质的高低直接关系到成品纯度。其中，红霉素B 和红霉素C 是红霉素发酵过程中产生的两种主要的杂质，其抗菌活性仅是红霉素A 的15%～20%，且红霉素B 和红霉素C 的毒性较大，而红霉素E 与红霉素F 由于含量极少，国内外关于其分离纯化及化学性质方面的报道较少[3]。关于它们的化学分子结构如图1 和表1 所示。

表1 组分结构汇总

图1 红霉素结构

目前，红霉素已经成为世界抗生素市场上的第三大类药物，国内对生产红霉素竞争激烈。但目前受发酵菌种与提取水平的限制，硫氰酸红霉素的提取收率低于80%，且产品纯度不高，影响了产品的性能[5]。传统的工序为陶瓷膜过滤、树脂脱色、纳滤浓缩、水相结晶、粗品精制，其中粗品精制是可以提升产品质量的关键环节[6]。杂质B 在精制过程中，易与硫氰酸钠反应结晶。本试验将采取分段结晶的方式控制结晶参数，对粗品精制进行优化提升产品纯度降低杂质含量。限于目前生产工序，如能降低产品杂质含量提升产品纯度，就能产生一定的经济效益。本研究立足于生产的实际情况，在不额外增加生产成本的情况下，实现产品效能增收。

1.试验与仪器

试验过程中所使用的仪器、试剂如图表2、表3所示。

表2 仪器列表

表3 试剂列表

2.试验方案

(1)不同pH分阶段精制试验

取一定质量的硫氰酸红霉素粗品溶于丙酮溶液，用液碱调pH 至澄清状态，然后用10%的氯化钠溶液分两次进行盐洗，静置一定时间将盐洗液分离干净。用冰醋酸调pH 至8.0 后加硫氰酸钠，出晶后抽滤得一次晶体Ⅰ，将结晶母液分两组进行试验：①组将结晶母液pH 回调至7.0，再加入一定体积的纯化水养晶一定时间，抽滤得二次晶体Ⅰ；②组将结晶母液pH 稳定在8.0，加一定体积纯化水养晶一定时间，抽滤得二次晶体Ⅱ；③组再取一定质量的硫氰酸红霉素粗品溶于丙酮溶液，用液碱调pH 至澄清状态，然后用10%的氯化钠溶液分两次进行盐洗，静置一定时间将盐洗液分离干净。用冰醋酸调pH 至8.5 后加硫氰酸钠得一次晶体Ⅲ，再将结晶母液回调pH 至7.0，加一定体积纯化水后养晶一定时间，抽滤得二次晶体Ⅲ。

(2)不同起始pH析晶试验

分别称取两份质量相等的硫氰酸红霉素粗品溶于丙酮溶液，用液碱调pH 为9.0，然后用10% 的氯化钠溶液分两次进行盐洗，静置一定时间将盐洗液分离干净。

试验一：溶液Ⅰ中加入硫氰酸钠溶液搅拌均匀，再滴加冰醋酸至晶体析出，离心过滤后得一次晶体Ⅰ和母液Ⅰ,将结晶母液Ⅰ调pH 至7.2，再加一定体积的纯化水养晶一定时间后，过滤得二次晶体Ⅰ。

试验二：溶液Ⅱ先调pH 至8.5，再加入硫氰酸钠，继续滴加冰醋酸至晶体析出，离心过滤，得一次晶体Ⅱ和母液Ⅱ，将结晶母液Ⅱ调pH 至7.2，再加一定体积的纯化水养晶一定时间后，过滤得二次晶体Ⅱ。

3.结果分析

(1)不同pH分阶段结晶对粗品精制组分的影响

取车间工艺中的粗品，按车间工艺对试验进行等比例缩小，验证调节pH 对粗品精制过程中组分的影响，结果如表4 和表5 所示。

表4 不同pH 分阶段结晶工艺数据

表5 各阶段总组分含量

由表4 可知，粗品精制过程中，一次晶体中的硫氰酸红霉素A 较粗品明显提升，杂质B 含量也明显提升，分别上升0.23%、0.14%，这表明杂质B 在一次结晶过程中易与硫氰酸钠反应形成晶体析出。由①、③两组试验可知，一次晶体Ⅲ中的A 组分含量较一次晶体Ⅰ高0.59%，一次晶体Ⅰ中杂质B 含量高于一次晶体Ⅲ。这表明，一次结晶过程中，将pH 控制在8.0 有利于杂质B 的去除。

由表4 和表5 中①、②两组试验可知，在二次结晶过程中，二次晶体Ⅰ和二次晶体Ⅱ中的总组分和杂质B 含量均无明显差异性，相对于粗品，杂质B 分别降低0.36%和0.37%，A 组分含量分别上升13.26%和13.71%，这表明不同pH 分阶段结晶可以有效去除精制液中杂质B 的含量，提升A 组分含量。二次晶体Ⅱ中A 组分含量较二次晶体Ⅰ高0.45%，这表明，在二次结晶过程中，将pH 控制在8.0 更有利于去除杂质B 提升A 组分含量。

(2)不同起始pH对晶体组分的影响

上述试验已经验证了不同pH 分阶段结晶对粗品精制组分的影响，本节试验主要验证不同起始pH 对晶体组分的影响。取用车间工艺中的粗品，按车间工艺对试验进行等比例缩小进行试验，结果如表6 所示。

表6 不同起始pH 析晶工艺数据

由表6 可知，一次结晶过程中，一次晶体中的硫氰酸红霉素A 组分较粗品均提升明显，杂质B 含量也均明显提高，分别升高0.19%和0.15%；二次结晶过程中，二次晶体Ⅰ中A 组分高于二次晶体Ⅱ，杂质B含量较二次晶体Ⅱ中的低，这表明在粗品精制试验过程中，起始pH 为9.0 时更有利于去除杂质B 提升A 组分含量。

4.结论

（1）不同pH 分段结晶试验中，通过对比试验可知，一次结晶过程中，将pH 控制在8.0 有利于杂质B的去除，二次结晶过程中，将pH 控制在8.0 有利于去除杂质B 提升A 组分含量。

（2）采用不同起始pH 析晶的方式进行粗品精制试验，实验结果显示，一次结晶过程中，一次晶体中的A 组分和杂质B 含量较粗品均提升明显，二次结晶过程中，二次晶体Ⅰ中A 组分高于二次晶体Ⅱ，杂质B 含量较二次晶体Ⅱ中的低，说明起始pH 为9.0 时更有利于去除杂质B 提升A 组分含量。